Ein neonatales Mausmodell charakterisiert die Übertragbarkeit von SARS

Apr 29, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3026 (2023) Diesen Artikel zitieren

1440 Zugriffe

35 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Kleintiermodelle stellten bei der Untersuchung der SARS-CoV-2-Übertragung eine Herausforderung dar, wobei die meisten Forscher Goldhamster oder Frettchen verwendeten. Mäuse haben die Vorteile niedriger Kosten, breiter Verfügbarkeit, geringerer regulatorischer und haltungstechnischer Herausforderungen sowie der Existenz einer vielseitigen Reagenzien- und genetischen Toolbox. Allerdings übertragen erwachsene Mäuse SARS-CoV-2 nicht stark. Hier etablieren wir ein Modell basierend auf neugeborenen Mäusen, das die Übertragung klinischer SARS-CoV-2-Isolate ermöglicht. Wir charakterisieren Tropismus, Replikation und Übertragung des angestammten WA-1 im Atemtrakt im Vergleich zu den Varianten Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) und Omicron BA.1 und Omicron BQ.1.1. Wir identifizieren Unterschiede zwischen den Varianten im Zeitpunkt und in der Größenordnung der Ausscheidung infektiöser Partikel von Indexmäusen, die beide die Übertragung auf Kontaktmäuse beeinflussen. Darüber hinaus charakterisieren wir zwei rekombinante SARS-CoV-2, denen entweder die ORF6- oder ORF8-Wirtsantagonisten fehlen. Die Entfernung von ORF8 verschiebt die Virusreplikation in Richtung der unteren Atemwege, was in unserem Modell zu einer deutlich verzögerten und verringerten Übertragung führt. Unsere Ergebnisse zeigen das Potenzial unseres neonatalen Mausmodells zur Charakterisierung viraler und Wirtsdeterminanten der SARS-CoV-2-Übertragung und zeigen gleichzeitig die Rolle eines akzessorischen Proteins in diesem Zusammenhang auf.

Trotz weltweiter Impfbemühungen und zunehmender natürlicher Immunität infizieren neu auftretende SARS-CoV-2-Varianten weiterhin Millionen von Menschen und belasten deren Gesundheit. Frühere besorgniserregende Varianten umfassen Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) und Omicron (B.1.1.529), während Omicron Sub- Die Linie XBB.1.5 dominiert derzeit die erste Hälfte des Jahres 20231. Varianten unterscheiden sich in Schlüsselgenen im gesamten viralen Genom, darunter Spike (S), ORF1a, ORF1b, Nucleocapsid (N), ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8, ORF9b, Envelope (E ) und Membran (M). Den Veränderungen in Spike wurde große Aufmerksamkeit geschenkt, da dieses Hüllglykoprotein das Antigen ist, auf das die meisten bisherigen Impfstrategien abzielen2 und der Schlüssel zum Viruseintritt in Zellen ist3. Weitere wichtige Hotspots, die Mutationen in SARS-CoV-2-Varianten akkumulieren, sind akzessorische Proteine, von denen SARS-CoV-2 8 kodiert, und einige dienen als Antagonisten der antiviralen Wirtsreaktion, insbesondere der Produktion und Reaktion von Typ-I-Interferon4,5,6 . Unser Wissen über SARS-CoV-2-ORFs beruht auf der Ableitung funktioneller Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-1 und anderen Coronaviren sowie auf Funktionsstudien unter Verwendung von ORF-cDNA-Überexpressionskonstrukten oder vollständig rekombinantem SARS-CoV-27,8,9,10. Die hohe Zahl von SARS-CoV-2-Infektionen, die mit dem Auftreten neuer Varianten zusammenfielen, gab Anlass zu Bedenken hinsichtlich einer verstärkten Übertragung dieser Varianten, was erhebliche Auswirkungen auf die Lösung der COVID-19-Pandemie hatte11.

Die molekulare Charakterisierung von SARS-CoV-2-Varianten ist für unsere Fähigkeit, geeignete antivirale Strategien zu entwickeln, von entscheidender Bedeutung. Frühere Studien haben SARS-CoV-2-Varianten durch die Bewertung der Rezeptorbindung und -affinität, der Antigen-Escape- und Replikationsdynamik sowie der Pathogenese und Immunevasion charakterisiert12,13. Vergleichende Studien zur Variantenübertragung und den molekularen Mechanismen, die variantenspezifische Übertragungsunterschiede steuern, sind jedoch noch rar. Dies ist teilweise auf Einschränkungen zurückzuführen, die aktuellen Tiermodellen wie Frettchen oder Hamstern innewohnen. Obwohl sie hervorragende Modelle für die Untersuchung der Pathogenese und Übertragung von SARS-CoV-2 sind14,15,16, erfordern sie eine spezielle Unterbringung, die Anzahl der Kontakttiere pro Index ist begrenzt, es fehlen artspezifische Reagenzien und es sind keine oder nur begrenzte genetische Daten verfügbar Manipulation, um mechanistische Studien zu Übertragungsfaktoren des Wirts durchzuführen. Im Gegensatz dazu bieten Mäuse einen vielseitigen und leicht verfügbaren genetischen Werkzeugkasten, und Reagenzien sind weithin verfügbar; dennoch übertragen erwachsene Mäuse Atemwegsviren wie Influenzaviren nicht effizient, obwohl sie anfällig für Infektionen sind17. Wir haben diese Hürde für das Influenzavirus zuvor mit neonatalen Mäusen überwunden17, einem Modell, das seit über 30 Jahren zur Untersuchung bakterieller Infektionen18,19 und der Übertragung seit 7 Jahren17,19,20,21,22 verwendet wird. Das Modell wurde auch von anderen erfolgreich angewendet, um die Übertragung von Maus-Parvoviren zu untersuchen23. Unsere vorherige Studie deckte influenzavirusstammspezifische Übertragungsunterschiede, die Rolle der humoralen Immunität beim Schutz der Influenzavirusübertragung und den Einfluss der Sialidase-Expression während einer Influenzavirus-Streptokokken-Pneumonie-Koinfektion auf17. Für SARS-CoV-2 ist das Modell jedoch nicht etabliert.

Hier stellen wir ein neugeborenes K18-hACE2-Mausmodell vor, das die Übertragung von SARS-CoV-2 zwischen Welpen desselben Wurfs ermöglicht, und wir untersuchen nebeneinander die Übertragung früher und aktueller besorgniserregender SARS-CoV-2-Varianten (VOC). Darüber hinaus charakterisieren wir die Übertragung von zwei rekombinanten SARS-CoV-2, denen die akzessorischen Proteine ​​ORF6 oder ORF8 fehlen. Unsere Studie unterstreicht die Leistungsfähigkeit unseres Modells zur Aufklärung der Dynamik der Übertragung von SARS-CoV-2-Varianten und liefert Hinweise darauf, dass ein akzessorisches Protein, ORF8, für die Übertragung von SARS-CoV-2 bei neugeborenen Mäusen von entscheidender Bedeutung ist. Unser handhabbares Kleintiermodell wird dabei helfen, einige der kritischsten Faktoren zu entschlüsseln, die an der Übertragung von SARS-CoV-2 beteiligt sind.

Während Influenzaviren Wildtyp-Mäuse leicht infizieren, sind das angestammte SARS-CoV-2 und die zuvor klinisch wichtige Delta-Variante auf die menschliche Version des SARS-CoV-2-Wirtszellrezeptors, ACE2, angewiesen und können das murine Ace224 nicht angreifen. Im Gegensatz dazu haben eine Reihe anderer SARS-CoV-2-Varianten spezifische Spike-Mutationen erworben, insbesondere N501Y, die es ihnen ermöglichen, murines Ace225 zu binden. Letztendlich wollten wir eine Reihe von Varianten, von Alpha bis Omicron, mit dem angestammten SARS-CoV-2 vergleichen. Vor diesem Hintergrund verwendeten wir in unserer Studie K18-hACE2-Mäuse, die menschliches ACE2 unter der Kontrolle des K18-Promotors exprimieren26.

Für SARS-CoV-2 liegen nur wenige Daten zur Übertragung bei erwachsenen Mäusen vor. Eine Studie berichtet über die Übertragung von SARS-CoV-2 B.1.351 (Beta) durch mit 5E6 FFU infizierte Indexmäuse über engen Kontakt27. Die Übertragung zwischen gemeinsam gehaltenen Mäusen im selben Käfig, bestimmt durch das Vorhandensein viraler RNA in oder die Serokonversion von Kontakten, betrug 41 bzw. 8 %. Infektiöse Viren wurden nicht bewertet. Die Übertragung von Influenzaviren bei erwachsenen Mäusen war ebenfalls ineffizient und steht im Widerspruch dazu, dass Übertragungsereignisse zwischen Forschungsgruppen nur schwer zu reproduzieren sind17,28,29. Dies machte das erwachsene Mausmodell zu einem unzuverlässigen Instrument zur Untersuchung der Übertragung von Influenzaviren. Um die Effizienz der SARS-CoV-2-Übertragung bei erwachsenen Mäusen in unseren Händen zu bestimmen, infizierten wir 13 Wochen alte K18-hACE2-Indexmäuse intranasal unter Narkose mit einer tödlichen Dosis (10.000 PFU, titriert in VeroE6-TMPRESS2-T2A). ACE2-Zellen) des angestammten SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 (WA-1). Ab dem Tag der Infektion hielten wir die infizierten Indexmäuse gemeinsam mit naiven Kontakten im Verhältnis 1 Index zu 2–3 Kontakten unter (ergänzende Abbildung 1a). Wir überwachten Morbidität (Gewichtsverlust) und Mortalität (humaner Endpunkt) und sammelten nicht-invasiv und ohne Anästhesie längs verlaufende Nasenproben, indem wir die Nasenlöcher in virale Medien eintauchten. So konnten wir die Kinetik der Ausscheidung im oberen Atemtrakt (URT) bei einzelnen Mäusen in Längsrichtung als Maß für die Virusinfektion nutzen. Im Gegensatz zu Indexmäusen beobachteten wir bei Kontaktmäusen bis zum Ende des Experiments (10 Tage nach der Indexinfektion) keine Morbidität oder Mortalität (ergänzende Abbildung 1b, c). Indexmäuse scheiden ab dem 1. bis 6. Tag nach der Infektion infektiöse Partikel aus, wobei der Höhepunkt der Virusausscheidung am 2. Tag erreicht wird (ergänzende Abbildung 1d). Wir haben zu jedem Zeitpunkt nur bei 1/9 (insgesamt 11 %) der Kontakttiere infektiöse Viren in URT-Ausscheidungsproben nachgewiesen (ergänzende Abbildung 1d). Dies war dasselbe Kontakttier, das bei 10 dpi immer noch infektiöse Titer im URT und in der Lunge aufwies (ergänzende Abbildung 1e). Bezogen auf den Käfig entsprach dies einem Übertragungswirkungsgrad von 0/3 (0 %), 0/3 (0 %) oder 1/3 (33 %). In einem Parallelexperiment haben wir die Übertragung durch Kontaktserokonversion bestimmt (ergänzende Abbildung 1f). PBS-infizierte Mäuse dienten als Negativkontrolle und Mäuse, die mit einer subletalen Dosis (1.000 PFU) infiziert wurden, als Positivkontrolle für die Serokonversion. Am experimentellen Endpunkt 22 Tage nach der Infektion stellten wir fest, dass 1/5 (20 %) der Kontaktmäuse serokonvertiert waren (ergänzende Abbildung 1f). Bezogen auf den Käfig entsprach dies einer Übertragung von 0/3 (0 %) oder 1/2 (50 %). Wir kamen zu dem Schluss, dass es bei erwachsenen K18-hACE2-Mäusen zu einer Kontaktübertragung von WA-1 kommt, wenn auch mit geringer Effizienz und hoher Variabilität von Käfig zu Käfig. Daher machten wir uns, ähnlich wie beim Influenzavirus-Übertragungsmodell, als nächstes daran, eine SARS-CoV-2-Infektion bei neugeborenen Mäusen zu etablieren.

Wir führten zunächst ein Dosis-Wirkungs-Experiment durch, um die minimale Virusdosis zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine robuste SARS-CoV-2-Infektion und -Ausscheidung bei Neugeborenen zu bewirken. Wir kombinierten C57BL/6 K18-hACE2+/+-Männchen und C57BL/6 (hACE2-/-)-Weibchen, um SARS-CoV-2 WA-1-permissive K18-hACE2+/--Nachkommen zu produzieren. Im Alter von 4 bis 7 Tagen wurden die Welpen ohne Betäubung intranasal mit 3 µL WA-1 ihrer Vorfahren infiziert. Wir verwendeten eine steigende Virusdosis von 1.500, 15.000 oder 50.000 PFU. Anschließend überwachten wir die Morbidität (fehlende Gewichtszunahme) und Mortalität (humaner Endpunkt) und sammelten täglich longitudinale Nasenausscheidungsproben, indem wir die Nasenlöcher in Sammelmedien eintauchten (ergänzende Abbildung 1g). Mit 1.500 PFU infizierte Welpen konnten bis zum dritten Tag nach der Infektion (3 dpi) nicht weiter an Gewicht zulegen und erlagen alle der Infektion um 4 dpi. Mit 15.000 oder 50.000 PFU infizierte Welpen starben bei 3 dpi, bevor ein nachweisbarer Gewichtsverlust auftrat (ergänzende Abbildung 1h, i). Die Titer des Nasenausscheidens zwischen Welpen, die mit 1.500, 15.000 oder 50.000 PFU infiziert waren, waren bei 1 und 2 dpi ähnlich, wurden jedoch bei 3 dpi deutlich (ergänzende Abbildung 1j): Die Titer von Welpen, die mit 1.500 PFU infiziert waren, sanken im Vergleich zu 2 dpi, wohingegen die Titer sanken von Welpen, die mit 15.000 PFU infiziert waren, blieben auf dem gleichen Niveau wie 2 dpi, und die Titer von Welpen, die mit 50.000 PFU infiziert waren, stiegen über den Wert an, der bei 2 dpi festgestellt wurde. Der festgestellte Unterschied im Haarausfalltiter zwischen der 1.500- und der 50.000-PFU-Gruppe bei 3 dpi betrug etwa das 100-fache. Dies zeigt, dass ein steigender Input-Titer die Dynamik der Virusausscheidung in unserem Modell modulieren kann. Da die niedrigste getestete Dosis von 1.500 PFU zu einer robusten Infektion führte und gleichzeitig ein zusätzlicher Tag für die Übertragung blieb, bevor Indexmäuse der Infektion erlagen, verwendeten wir 1.500 PFU als standardisiertes Inokulum in nachfolgenden Experimenten zur Infektion mit neugeborenen Mäusen.

Als nächstes testeten wir die Übertragung von WA-1 innerhalb eines Wurfs bei neugeborenen Mäusen. Wir infizierten 4–7 Tage alte K18-hACE2+/--Indexmäuse mit 1.500 PFU WA-1 und setzten sie zurück zum (nicht permissiven) Muttertier und ihren (permissiven) naiven Wurfgeschwistern in einem Verhältnis von 1 Index zu 4–6 Kontakten Mäuse (Abb. 1a). Wir beobachteten zunächst, dass sowohl Morbidität als auch Mortalität bei Kontaktmäusen im Vergleich zu Indexmäusen um 2–3 Tage ausgeglichen waren (Abb. 1b, c), was auf eine erfolgreiche Übertragung hinweist. Bei Indexmäusen konnten wir SARS-CoV-2-RNA bereits bei 1 dpi nachweisen und erreichten einen Spitzenwert von 2 dpi, während einige Kontaktwelpen ab 2 dpi damit begannen, virale RNA auszuscheiden, wobei der Höchstwert bei 4 dpi lag (Abb. 1d). Ein paralleles Experiment mit hitzeinaktiviertem SARS-CoV-2 zeigte, dass die viralen Genome in den Ausscheidungsproben auf eine aktive Virusreplikation und nicht auf eine Übertragung von Inokula zurückzuführen sind (ergänzende Abbildung 1k). Der Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in Kontaktmäusen war somit ein weiterer Hinweis auf eine Übertragung. Wir definieren Übertragung jedoch streng als den anhaltenden Nachweis infektiöser Viruspartikel bei Kontaktmäusen. Daher haben wir die Virustiter in nasalen Ausscheidungsproben mittels Plaque-Assay bestimmt. Infektiöse Partikel von Indexmäusen (Abb. 1e) korrelierten mit dem Einsetzen und Nachlassen des RNA-Nachweises (Abb. 1d). Der Nachweis infektiöser Partikel bei Kontaktwelpen bestätigte die Übertragung von SARS-CoV-2. Infektiöse Partikel in Kontaktpersonen erreichten am 4. Tag ihren Höhepunkt und nahmen am 5. und 6. Tag ab, ähnlich wie bei den SARS-CoV-2-RNA-Trends. Bemerkenswert ist, dass alle Kontaktwelpen am vierten Tag infektiöse Partikel ausscheiden, was in unserem Modell 16/16 (100 %) der Übertragung von WA-1 entspricht.

a Vier bis sieben Tage alte K18-hACE2+/--Welpen wurden intranasal mit 1500 PFU SARS-CoV-2 WA-1 infiziert und 6 Tage lang zusammen mit nicht infizierten Wurfgeschwistern gehalten. Gewicht und Überleben wurden täglich überwacht und Virenausscheidungsproben wurden gesammelt, indem die Nasenlöcher jedes einzelnen Welpen täglich in Virusmedium getaucht wurden. Daten aus zwei unabhängigen Wiederholungen mit insgesamt n = 4 Index- und n = 9 Kontaktmäusen. Mittleres Körpergewicht (b) und Überleben (c) von Index- und Kontaktwelpen. Viruslast in Ausscheidungsproben, analysiert mittels RT-qPCR auf SARS-CoV-2-RNA (d) und mittels Plaque-Assay auf infektiöse Viren (e). Die Daten werden als geometrischer Mittelwert (Linie) mit geometrischer Standardabweichung (schattierter Bereich) angezeigt. Einzelne Werte unterhalb der Nachweisgrenze (50 PFU/ml) wurden auf 5 gesetzt. f Immunhistochemie für SARS-CoV-2 N-Protein im Nasopharynx von 4–7 Tage alten Mäusen. Die Welpen wurden intranasal mit 1.500 PFU SARS-CoV-2 WA-1 infiziert und die Köpfe wurden bei 2 dpi fixiert, in Paraffin eingebettet, durch den Nasopharynx geschnitten und auf SARS-CoV-2 N-Protein (gelb) und DAPI (blau) gefärbt ) für Kerne. Pfeile stellen vergrößerte Bereiche in den angrenzenden Feldern dar. OE und RE zeigen Riechepithel bzw. Atemwegsepithel an. Erstellt mit BioRender.com.

Der Nachweis infektiöser Partikel in Proben von neugeborenen K18-hACE2-Mäusen deutete auf eine starke Virusinfektion im URT hin. Um die Infektionsherde innerhalb der URT in räumlicher Granularität zu bestimmen, führten wir eine Immunhistochemie (IHC) am Nasopharynx von Indexwelpen durch. Köpfe neugeborener Mäuse wurden auf dem Höhepunkt der Virusausscheidung (2 dpi) geerntet, durch den Nasopharynx geschnitten und auf SARS-CoV-2 N-Protein gefärbt. Wir haben SARS-CoV-2-positive Zellen in der oberen Riech- und Atemwegsepithelauskleidung nachgewiesen, was die Replikation von SARS-CoV-2 WA-1 in Zellen des URT zeigt (Abb. 1f). Zusammengenommen etablieren und validieren diese Ergebnisse ein handhabbares neugeborenes K18-hACE2-Mausmodell für die Übertragung von SARS-CoV-2.

Es wurde vorgeschlagen, dass die hohe Übertragbarkeit der Alpha- und Delta-Varianten von SARS-CoV-2 durch eine effiziente URT-Replikation und -Ausscheidung bedingt ist30,31. Dies steht im Gegensatz zur Influenzavirus-Literatur, in der die URT-Replikation nicht mit der Aerosolerzeugung oder -übertragung beim Menschen korreliert32. Mithilfe des neugeborenen Mausmodells haben wir experimentell rekapituliert, dass die Übertragungseffizienz des Influenzavirus nicht mit den URT-Titern korreliert, sondern vielmehr mit der Menge des ausgeatmeten Virus in den ausgeschiedenen Sekreten17. Andere haben gezeigt, dass die Übertragung von Influenzaviren sowohl vom Zeitpunkt als auch vom Ausmaß der Spitzenausbreitung abhängt33,34. Ähnliche Beobachtungen wurden für SARS CoV-2 bei syrischen Hamstern beobachtet, bei denen die oralen Virustiter aus Abstrichtupfern ein schlechter Indikator für die Ausscheidung über die Luft waren, die maximale Virusausscheidung über die Luft in die Umwelt jedoch mit der Übertragung korrelierte35.

Um die Indexkorrelate der SARS-CoV-2-Übertragung in unserem Modell zu identifizieren, haben wir die Viruslast in verschiedenen Atemwegskompartimenten charakterisiert: untere Atemwege (Lungenhomogenate), URT (Retro-Trachealspülungen) oder ausgeschiedene Sekrete (ausgestoßene Viren). Wir begannen damit, die Dynamik der Virusreplikation innerhalb dieser Kompartimente für das angestammte WA-1-Virus zu bewerten. 4–7 Tage alte K18-hACE2+/--Welpen wurden mit 1.500 PFU WA-1 infiziert und die infektiöse Partikelbelastung im jeweiligen Probentyp bei 1, 2 und 3 dpi gemessen (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. 2a). . Bei 1 dpi waren sowohl die Ausscheidungs- als auch die URT-Titer höher als die Lungentiter, wenn auch statistisch nicht signifikant. Bei 2 dpi waren die Ausscheidungs-, URT- und Lungentiter im Titer einander ähnlich. Bei 3 dpi sanken die Ausscheidungstiter, während die Lungentiter anstiegen, was zu Lungentitern führte, die deutlich höher waren als die Ausscheidungstiter. Dies deutet darauf hin, dass in unserem Modell eine SARS-CoV-2 WA-1-Infektion, die in geringer Menge intranasal ohne Anästhesie verabreicht wird, im Laufe der Zeit vom URT in die Lunge fortschreitet.

a Neugeborene K18-hACE2+/--Mäuse wurden mit dem angegebenen SARS-CoV-2 infiziert und es wurden täglich Proben zur Virusausscheidung entnommen. Bei 2 dpi wurden retrotracheale Lavagen und Lungen gesammelt, um die Virustiter zu bestimmen, und die Köpfe wurden für die Immunhistochemie fixiert. b–g Viruslast in täglichen Ausscheidungsproben (links) und bei 2 dpi in Ausscheidungsproben, oberen Atemwegen und Lungen (rechts). Einzelne Werte unterhalb der Nachweisgrenze (LOD, 50 PFU/ml) wurden auf 5 gesetzt. Daten aus mindestens 2 unabhängigen Wiederholungen mit n = 6 – 15 Jungtieren pro Gruppe. Es werden nur signifikante p-Werte (Kruskal-Wallis-Test) dargestellt. h Immunhistochemie für SARS-CoV-2 N bei 2 dpi im Nasopharynx. Erstellt mit BioRender.com.

Als nächstes verglichen wir die URT-Ausscheidungsdynamik des angestammten Virus und seiner Varianten. Wir haben zunächst klonale (Plaque-gereinigte), Saccharose-gereinigte und tief sequenzierte virale Arbeitsbestände generiert. Diese strenge Qualitätskontrollpipeline gewährleistet die Identität von VOCs (d. h. das Vorhandensein von Varianten-definierenden Mutationen) und ihre Integrität (das Fehlen von durch Gewebekulturen verursachten Mutationen). Anschließend infizierten wir K18-hACE2+/--Welpen mit 1.500 PFU von Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) und Omicron BA .1 oder Omicron BQ.1.1. Wir bestimmten zunächst die Dynamik der Ausscheidung infektiöser Viren für jedes Isolat von 1 bis 4 dpi oder bis die Welpen der Infektion erlagen (Abb. 2a, ergänzende Abb. 3). Die Ausscheidung von Mäusen, die mit WA-1 der Vorfahren infiziert waren, erreichte ihren Höhepunkt bei 2 dpi, bevor sie um 3 dpi abnahm (Abb. 2b). Im Gegensatz zu WA-1 erreichte die Ausscheidung von mit Alpha infizierten Mäusen früher ihren Höhepunkt bei 1 dpi und nahm steil um 2 dpi ab (Abb. 2c). Die Ausscheidung von Mäusen, die mit Beta infiziert waren, erreichte ebenfalls einen Spitzenwert von 1, blieb aber im Gegensatz zu Alpha bei 2 dpi auf dem gleichen Niveau, bevor sie bei 3 dpi abnahm, was zu einem Titer führte, der dem von WA-1-infizierten Jungtieren ähnelte (Abb. 2d). Die Ausscheidung von Mäusen, die mit Gamma und Delta infiziert waren, hatte eine ähnliche Steigung wie WA-1, mit einem Spitzenwert bei 2 dpi, bevor sie um 3 dpi abnahm (Abb. 2e, f). Die Ausscheidungstiter von Gamma-infizierten Welpen waren im Durchschnitt niedriger als die von WA-1-infizierten Welpen, wenn auch statistisch nicht signifikant (Abb. 2e). Mit den Omicron-Isolaten BA.1 oder BQ1.1 infizierte Mäuse scheiden insgesamt geringe Virusmengen aus, wobei die meisten Replikate unterhalb der Nachweisgrenze liegen (Abb. 2g, ergänzende Abb. 2d). Diese beiden Omicron-Varianten unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Abwurfkinetik: Der Abwurf von BQ.1.1 erreichte seinen Höhepunkt bei 1 dpi gegenüber BA.1 bei 3 dpi (Abb. 2g, ergänzende Abb. 2d). Somit ist unser Modell in der Lage, die einzigartige Kinetik der URT-Ausscheidung der SARS-CoV-2-Variante von infizierten Welpen zu erfassen.

Als nächstes verglichen wir die Orte der Virusreplikation für jede Variante und stellten fest, dass die Verteilung der Viruslast in verschiedenen Probentypen für bestimmte Viren unterschiedlich ist. Für Alpha waren die Ausscheidungs- und URT-Titer bei 2 dpi in ihrer Größenordnung mit 2 dpi WA-1 vergleichbar (Abb. 2b, c), aber die Lungentiter waren tendenziell niedriger (Abb. 2c). Um festzustellen, ob diese niedrigeren Lungentiter eine Folge des früheren Einsetzens und Nachlassens der Replikation und des Ausscheidens bei Alpha waren, haben wir die Alpha-Viruslasten in den drei Kompartimenten auch am Tag des höchsten Ausscheidens bei Alpha, 1 dpi, untersucht (ergänzende Abbildung 2b, linkes Feld). Auch hier fanden wir deutlich höhere Titer in den Shedding- und URT-Proben als in der Lunge, was darauf hindeutet, dass sich Alpha in unserem Modell sowohl bei 1 als auch bei 2 dpi in der URT besser repliziert. Für Beta, Gamma und Delta fanden wir keine signifikanten Unterschiede in den Titern zwischen ausgeschiedenem Virus, URT und Lunge, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit zur Infektion und Replikation sowohl im URT als auch im unteren Atemtrakt gleich ist und aus dem URT ausgeschieden wird (Abb. 2d). -F). Tatsächlich bestätigte das IHC der URT-Region, dass WA-1, Alpha, Beta, Gamma und Delta das URT effizient infizieren (Abb. 2h). Im Gegensatz dazu waren die BQ1.1-Titer in URT und Lunge bei 2 dpi nicht nachweisbar (Abb. 2g), und IHC zeigte keine mit Omicron BQ.1.1 infizierten Zellen im URT-Epithel (Abb. 2h). Um festzustellen, ob diese nicht nachweisbaren Titer eine Folge des früheren Einsetzens und Nachlassens der Replikation und Ausscheidung von BQ1.1 waren, haben wir die Viruslast von Omicron BQ.1.1 in den drei Kompartimenten auch am höchsten Tag der Ausscheidung, 1 dpi, getestet. Wir stellten fest, dass die durchschnittlichen Titer in allen drei Kompartimenten immer noch niedrig waren und dass einige Proben bei Ausscheidungs- und URT-Proben über der Nachweisgrenze lagen (ergänzende Abbildung 2c). Diese Ergebnisse ähnelten den 1-dpi-Daten, die für Omicron BA.1 erhalten wurden (ergänzende Abbildungen 2e, f). Für keine der Omicron-Untervarianten wurden in der Lunge infektiöse Omicron-Partikel nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass sich Omicron in neugeborenen K18-hACE2-Mäusen nicht effizient repliziert (Abb. 2g, ergänzende Abb. 2e). Unsere Ergebnisse stimmen mit Erkenntnissen anderer überein und zeigen, dass Omicron-Varianten bei Hamstern und Mäusen abgeschwächt sind, obwohl im K18-Modell der Rezeptor hACE2 vorhanden ist24,36,37.

Interessanterweise waren die Viruslasten in den Ausscheidungsproben bei allen Virusisolaten denen aus den jeweiligen retrotrachealen Lavageproben ähnlich, was zeigt, dass die getesteten SARS-CoV-2-Viren in unserem Modell keinen Defekt bei der Virusausscheidung und damit bei der URT aufweisen Shedding kann als Proxy für die SARS-CoV-2-URT-Replikation verwendet werden.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass unser Modell mit Ausnahme der Omicron-Varianten eine effiziente Replikation und Ausscheidung von SARS-CoV-2-Varianten in vergleichbaren Mengen wie das angestammte WA-1 ermöglicht. Die zeitliche Ausscheidungskinetik unterscheidet sich zwischen den Varianten und ermöglicht die Verwendung dieses Modells als Werkzeug zum Verständnis der Mechanismen der Übertragung von SARS-CoV-2-Varianten.

Als nächstes nutzten wir unser Panel von SARS-CoV-2-Varianten, das von frühen bis aktuellen Pandemie-Isolaten reichte, um die Übertragung zu testen. 4–7 Tage alte Index-K18-hACE2+/--Mäuse wurden entweder mit SARS-CoV-2 WA-1, Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron BA.1 oder Omicron BQ.1.1 infiziert und zusammen mit naiven Neugeborenen gehalten Mäuse im Verhältnis 1:6-9. WA-1-, Alpha-, Beta- und Delta-infizierte Indexmäuse erlagen alle einer Infektion um 3 dpi (ergänzende Abbildungen 3a-c, e). Gamma-infizierte Indexmäuse erlagen um 4 dpi (ergänzende Abbildung 3d). Bei Delta- und Omicron BA.1-infizierten Indexmäusen waren Morbidität (fehlende Gewichtszunahme) und Mortalität verzögert, und bei Omicron BQ.1.1-infizierten Indexmäusen konnten wir keine wesentliche Morbidität, sondern eine vollständige, aber verzögerte Mortalität feststellen Indexmäuse (Ergänzende Abbildung 3e-g). Übertragungsereignisse, die zu späten Zeitpunkten, nach dem Tod der Indexwelpen, auftreten, können entweder auf einen späten Beginn des Kontaktabwurfs oder auf eine sequentielle Übertragung zwischen Kontakten zurückzuführen sein. Mit Ausnahme der beiden Omicron-Varianten erlagen einige oder alle Kontaktmäuse in Käfigen mit anderen Varianten einer Infektion um 7 dpi (ergänzende Abbildung 3).

Als nächstes untersuchten wir die Dynamik der Übertragung mithilfe von zwei nicht-redundanten Messwerten von Kontaktwelpen: 1. Zeitpunkt der Virusakquise durch Kontaktpersonen: Wir quantifizieren die Virusakquise durch Kontaktwelpen als „Übertragungsereignisse“, wenn das Virus mindestens zweimal in abgegebenen Proben nachgewiesen wird (Abb . 3). Als Beginn der Ansteckung gilt der erste Tag der Virusausscheidung bei jedem Kontakt („infektiöses Virus-positiv“). Dadurch können wir die Virusakquisition als Funktion der Zeit bewerten und die Kinetik der Akquisition zwischen Varianten vergleichen. Diese Anzeige spiegelt jedoch nicht das Ausmaß der Kontaktinfektion wider. 2. Nachweis von Virustitern durch URT-Ausscheidung von Kontakttieren: Diese Maßnahme ermöglicht die Erkennung subtiler Schwankungen im Ausmaß der Kontaktausscheidung. Die in unseren Experimenten beobachteten Unterschiede in der Ausscheidungsamplitude können auf die Unterschiede in der Ausscheidung durch die Indexmäuse (dh die Infektionsdosis und den Zeitpunkt der Übertragung durch den Index) und/oder auf Unterschiede in der viralen Replikationsfitness bei Kontakten zurückzuführen sein. Veränderungen in den Kontaktverlusttitern können bei sequentiellen Übertragungsexperimenten von Bedeutung sein, bei denen Kontakte zum Index für naive Personen werden. Für WA-1 und Alpha wurde 100 % Transmission bei 3 bzw. 4 dpi erreicht, wobei die Steigungen nicht signifikant unterschiedlich waren (Abb. 3a, linkes Feld). Bei einigen Kontaktmäusen wurden bereits bei 1 dpi infektiöse Partikel des angestammten WA-1 und Alpha nachgewiesen, und die Alpha-Werte waren bei 3 dpi deutlich höher als die WA-1-Werte, was auf einen leichten Übertragungsvorteil von Alpha schließen lässt. Die Alpha-Kontakt-Ausscheidungstiter erreichten ihren Höhepunkt bei 4 dpi und verblassten früher als bei WA-1, beginnend bei 4 dpi (Abb. 3a, rechtes Feld), was mit dem frühen Abfall der Ausscheidungstiter übereinstimmt, der zuvor bei Alpha-Indexmäusen beobachtet wurde (Abb . 2c). Im Gegensatz zu Alpha zeigten Beta-Kontaktmäuse im Vergleich zu WA-1 eine deutlich verzögerte Akquisition (Abb. 3b, linkes Feld), erreichten jedoch ähnliche Spitzenkontakttiter (Abb. 3b, rechtes Feld). Gamma-Kontaktmäuse zeigten im Vergleich zu WA-1 eine deutlich verzögerte Akquisition (Abb. 3c, linkes Feld) und erreichten insgesamt eine Übertragung von 73 %. Mäuse mit Gamma-Kontakt hatten insgesamt auch eine geringere Viruslast, obwohl die Kinetik zum und vom Spitzentiter der von WA-1 ähnelte (Abb. 3c, rechtes Feld). Wie Gamma hinkten Delta-Kontaktmäuse den WA-1-Kontaktmäusen hinsichtlich der Akquisition deutlich hinterher (Abb. 3d, linkes Feld), und die Spitzenwerte des infektiösen Virus bei Delta-Kontakten waren denen von WA-1 ähnlich (Abb. 3d, rechtes Feld). Mit Delta infizierte Kontakte schütteten bis zum Ende des Experiments weiterhin infektiöse Partikel bei 7 dpi aus (Abb. 3d, rechtes Feld). Omicron BA.1-Kontaktmäuse infizierten sich in unserem Modell nicht und schieden kein infektiöses Virus aus (Abb. 3e), was mit anderen Berichten übereinstimmt, die zeigen, dass Omicron BA.1 abgeschwächt ist und die Übertragung durch die Luft bei Nagetieren verringert ist24,36,37 ,38. Interessanterweise und im Gegensatz zu BA.1 erreichten Omicron BQ.1.1-Kontaktmäuse in unserem Modell eine Übertragung von 25 % (Abb. 3f, linkes Feld). BQ.1.1. Index-Ausscheidung mit außergewöhnlich niedrigen Virustitern (Abb. 2g), was einer geringeren Übertragungsrate und geringer Kontaktausscheidung entsprach (Abb. 3f, rechtes Feld). Der Übertragungsunterschied zwischen BA.1 und BQ.1.1 war überraschend, da die Peak-Shedding-Titer beider Omicron-Subvarianten bei Indextieren gleich niedrig waren (Abb. 2g, ergänzende Abb. 2c). Es ist möglich, dass der Zeitpunkt der Spitzenablösung (1 dpi für BQ.1.1 vs. 3 dpi für BA.1) der entscheidende Faktor für die Omicron-Übertragung in unserem Modell ist. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass das Ausmaß des Indexverlusts mit dem Erfolg der Übertragung an Kontakte korrespondiert (ergänzende Abbildung 2g).

Neugeborene K18-hACE2+/--Mäuse wurden mit dem angegebenen SARS-CoV-2 infiziert und 7 Tage lang gemeinsam mit nicht infizierten Wurfgeschwistern im Verhältnis 1:6-9 gehalten. Der Erwerb einer Infektion durch und die Viruslast bei Kontaktmäusen wurde täglich überwacht. Ancestral WA-1 wurde mit den Varianten Alpha (a), Beta (b), Gamma (c), Delta (d), Omicron BA.1 (e) und Omicron BQ1.1 (f) verglichen. Die linken Felder zeigen den Prozentsatz der Virusakquisition in invertierten Kaplan-Meier-Diagrammen. Der Beginn der Ansteckung wurde als erster Tag des nachhaltigen Nachweises infektiöser Viren gewertet. Die rechten Felder zeigen die durch Plaque-Assay ermittelte Viruslast in Proben, die Kontakt ausscheiden. Die Daten werden als geometrischer Mittelwert (Linie) mit geometrischer Standardabweichung (schattierter Bereich) angezeigt. Einzelne Werte unterhalb der Nachweisgrenze (50 PFU/ml) wurden auf 5 gesetzt. Daten aus mindestens 2 unabhängigen Wiederholungen, n = 1 Index und 4–6 Kontaktwelpen pro Wiederholung. Es werden nur signifikante p-Werte (Mantel-Cox-Log-Rank-Test für Kaplan-Meier-Plots, Kruskal-Wallis-Test für Viruslast) dargestellt.

Als nächstes charakterisierten wir das URT-Entzündungsrepertoire von Indexmäusen nach viraler Belastung in unserem Modell. Es wird erwartet, dass eine antivirale/entzündliche Reaktion auf eine Infektion das Virus im Wirt abschwächt, was zu einer verringerten Übertragung führt5,39. Eine verstärkte Entzündung kann jedoch auch URT-Sekretionen induzieren, die dazu beitragen, das Virus in die Umwelt auszustoßen, was die Übertragung begünstigen kann20,22. Wir analysierten die in URT-Ausscheidungsproben von Indexmäusen vorhandenen Zytokine durch Multiplex-ELISA nach 6, 24 und 48 Stunden, wobei wir hitzeinaktiviertes (HI) SARS-CoV-2 WA-1 oder Poly (I:C) als Kontrollen verwendeten. Wir haben das Vorhandensein mehrerer Zytokine in mit Poly (I: C) behandelten Mäusen zum Zeitpunkt 48 Stunden festgestellt, wenn auch in niedrigeren Konzentrationen als bei WA-1-infizierten Mäusen (ergänzende Abbildung 4a). HI WA-1 konnte zu bestimmten Zeitpunkten keine messbare Entzündung auslösen, wohingegen wir in Proben von WA-1-infizierten Mäusen nach 48 Stunden einen erhöhten Zytokinspiegel feststellten (ergänzende Abbildung 4a). Dies legt nahe, dass unsere gereinigten Virusbestände kein exogenes Entzündungsmaterial enthalten, dass eine aktive WA-1-Replikation erforderlich ist, um die Entzündung in unserem Modell voranzutreiben, und dass der 48-Stunden-Zeitpunkt optimal ist, um das Zytokinprofil in URT-Ausscheidungsproben zu messen.

Um einen möglichen Zusammenhang zwischen Index-URT-Entzündung und -Übertragung zu untersuchen, haben wir Zytokine in Stichproben von Indexmäusen gemessen, die entweder mit SARS-CoV-2 WA-1 der Vorfahren oder den Varianten Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron BA.1 und Omicron BQ infiziert waren .1.1 bei 48 PSi. Vergleichbare Titer der infektiösen Virusausscheidung zu diesem Zeitpunkt für die meisten Varianten, zwischen 104 und 105 PFU/ml (Abb. 2), ermöglichten einen qualitativen Vergleich der Zytokinsignaturen zwischen diesen gleichermaßen replizierenden Viren. Beide Omicron-Varianten wiesen bei 48 hpi (101 PFU/ml, Abb. 2g) viel niedrigere Virusausscheidungstiter auf, und dementsprechend waren die Zytokinsignaturen für beide Omicron-Varianten bei 48 hpi ruhig (ergänzende Abb. 4b). Bemerkenswert ist, dass wir bei 24 hpi, dem Spitzenzeitpunkt der Ausscheidung von BQ.1.1, erhöhte Zytokinspiegel im BQ.1.1-infizierten Index festgestellt haben (Abb. 2g, Erweiterte Daten 4c), aber keinen solchen Anstieg bei BA.1 festgestellt haben. infizierte Mäuse, bei denen der Haarausfall später bei 72 hpi seinen Höhepunkt erreicht (ergänzende Abbildung 2d, ergänzende Abbildung 4c). Für gleichermaßen replizierende Viren (WA-1, Alpha, Beta, Gamma und Delta) stellten wir fest, dass sich die Zytokinsignatur bei einer WA-1-Infektion der Vorfahren am stärksten von den Signaturen bei einer Infektion mit Varianten unterschied (ergänzende Abbildung 4b). Gamma- und Alpha-Signaturen gruppierten sich, ebenso wie Alpha- und Delta-Signaturen. Der Satz der wichtigsten hochregulierten Zytokine war bei gleich replizierenden Viren ähnlich (ergänzende Abbildung 4b, oberer linker Quadrant), aber die Amplitude der Hochregulierung unterschied sich zwischen den Viren. Bemerkenswerterweise korrelierte der Zytokinclusterabstand der verschiedenen Viren mit ihrer jeweiligen Übertragungseffizienz (ergänzende Abbildung 4d), mit Ausnahme von Alpha. Weitere Studien sind erforderlich, um herauszufinden, ob und welche spezifischen URT-Zytokine, die durch Indexwelpen induziert werden, zur Übertragung beitragen (ergänzende Abbildung 4b und Abbildung 3). Unser Modell und die Verfügbarkeit transgener Mäuse mit Unterbrechungen wichtiger Zytokinwege ermöglichen es uns auf einzigartige Weise, diese zukünftigen Studien durchzuführen.

Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass unser neonatales Mausmodell Unterschiede in der Übertragungsdynamik charakterisieren kann, die SARS-CoV-2-Varianten innewohnen. Unsere tägliche Methode der Virusprobenahme ermöglicht die Verfolgung der Virusreplikation in einzelnen Index- und Kontaktmäusen im Laufe der Zeit und sorgt für eine detaillierte Darstellung der Übertragungsparameter, einschließlich der Assoziation von variantenspezifischen Zytokinsignaturen und der Übertragung.

Zusätzlich zu Mutationen im Spike weisen mehrere SARS-CoV-2-Varianten Mutationen in akzessorischen Genen wie ORF3, ORF6, ORF7 und ORF8 auf, die mit der Beeinträchtigung der Immunsignalisierung oder der direkten Gegenwirkung von Wirtseffektoren in Verbindung gebracht werden6,8,10 ,40,41,42,43,44. Der selektive Vorteil von Veränderungen in diesen akzessorischen Proteinen, falls vorhanden, bleibt ungeklärt, insbesondere im Hinblick auf die Übertragung. Wir wollten daher herausfinden, wie sich das Fehlen spezifischer akzessorischer Proteine ​​auf die SARS-CoV-2-Übertragung in unserem Modell auswirkt, und konzentrierten uns auf zwei akzessorische Proteine: ORF8, weil es Mutationen aufweist, die die Alpha-, Gamma- und Delta-Varianten definieren, und ORF6, das in den in dieser Studie verwendeten Varianten keine Mutationen aufweist, aber in einigen Omicron-Varianten (z. B. BA.2, BA.4) mutiert ist und außerdem eines der am besten charakterisierten SARS-CoV-2-Akzessorproteine ​​ist1,42,43, 44. Beide rekombinanten Viren wurden in kultivierten Zellen und in erwachsenen K18-hACE2-Mäusen charakterisiert45 und zeigten reduzierte Virustiter in vitro, aber ähnliche Lungentiter in vivo. Interessanterweise zeigte das Virus, dem ORF8 fehlt, einen erhöhten Lungenpathologie-Score45, was darauf hindeuten könnte, dass durch dieses Virus ein verstärkter Entzündungsprozess induziert wird.

Wir infizierten neugeborene K18-hACE2+/--Mäuse mit 1500 PFU rekombinantem SARS-CoV-2 WA-1 (rWA-1), rekombinantem SARS-CoV-2 ohne ORF6 (ΔORF6) oder rekombinantem SARS-CoV-2 ohne ORF8 ( ΔORF8). Ähnlich wie bei unseren vorherigen Beobachtungen mit dem klinischen WA-1-Isolat (Abb. 2b) erreichten die Ausscheidungstiter von rWA-1-Indexmäusen ihren Höhepunkt bei 2 dpi und sanken um 3 dpi (Abb. 4a, linkes Feld). Der Index-Shedding von ΔORF6-infizierten Mäusen war in der Kinetik ähnlich wie bei rWA-1, mit einem Trend geringerer Stärke (5-fach bei 2 dpi, Abb. 4b, linkes Feld). Mit ΔORF8 infizierte Indexmäuse scheiden durchweg bis zu 100-fach weniger Viren aus als mit rWA-1 infizierte Mäuse (Abb. 4c, linkes Feld) und überlebten daher einen Tag länger als mit rWA-1 infizierte Indexmäuse (ergänzende Abb. 5a-c). Bei 4 dpi löst es sich immer noch. Als nächstes analysierten wir die Virusreplikation in Ausscheidungsproben (ausgestoßenes Virus), URT-Lavagen (URT-Replikation) und Lungen (Replikation der unteren Atemwege) von Indexmäusen. Wie beim WA-1-Isolat beobachteten wir viel höhere rWA-1-Titer in der Lunge als in den URT- und Shedding-Proben (Abb. 4a, rechtes Feld). Für ΔORF6 erhielten wir in allen drei Probentypen ähnliche Titer, durchschnittlich 1×104 PFU/ml, obwohl es eine breite Verteilung gab, wobei einige Jungtiere in der Lunge höhere Virustiter aufwiesen als in Proben, die sich ausscheiden oder URT-Proben (Abb. 4b, rechts). Panel). Wir kamen zu dem Schluss, dass in unserem Modell das Fehlen von ORF6 die Virusreplikation und -ausscheidung nicht signifikant abschwächte oder den Gewebetropismus in Bezug auf das elterliche rWA-1 signifikant veränderte. Bei ORF8 war das anders. Die ΔORF8-Ablösung und die URT-Titer waren niedriger als für rWA-1 oder ΔORF6 (Abb. 4c, linkes Feld). Überraschenderweise war die Viruslast in der Lunge vergleichbar mit der von rWA-1 und WA-1 ΔORF6. Dies ähnelte früheren Befunden bei erwachsenen Mäusen, bei denen der Mangel an ORF8 die Lungentiter nicht veränderte41,45. Somit scheint das Fehlen von ORF8 die Fähigkeit von ΔORF8, sich speziell im URT robust zu replizieren, erheblich zu verringern.

Neugeborene K18-hACE2+/- Mäuse wurden intranasal mit 1500 PFU rekombinantem WA-1 (rWA-1), rWA-1 ohne ORF6 (ΔORF6) oder rWA-1 ohne ORF8 (ΔORF8) infiziert. ac Viruslast in täglichen Ausscheidungsproben (links) und in 2-dpi-Ausscheidungsproben, obere Atemwege (URT) und Lunge (rechts). Daten von mindestens n = 5 Welpen pro Gruppe. df Prozentsatz der Virusakquisition, dargestellt in invertierten Kaplan-Meier-Diagrammen und virale Infektionslast in Proben, die Kontakt ausscheiden, dargestellt als geometrischer Mittelwert (Linie) mit geometrischer Standardabweichung (schattierter Bereich). Daten aus mindestens 2 unabhängigen Wiederholungen mit n = 1 Index und jeweils 4–6 Kontakten. af Es werden nur signifikante p-Werte (Mantel-Cox-Log-Rank-Test für Kaplan-Meier-Plots, Kruskal-Wallis-Test für Viruslast) dargestellt. Einzelne Werte unterhalb der Nachweisgrenze (LOD, 50 PFU/ml) wurden auf 5, g eingestellt. Heatmap, die Zytokinspiegel bei 2 dpi in retrotrachealen Lavagen und Lungen darstellt, gemessen durch Multiplex-ELISA. Die Daten repräsentieren eine um dasfache höhere Induktion gegenüber mit PBS inokulierten Jungtieren. Mindestens n = 3 Welpen pro Bedingung. h Immunhistochemie für SARS-CoV-2 N bei 2 dpi im Nasopharynx.

Als nächstes führten wir Übertragungsexperimente mit den drei rekombinanten Viren durch. Wie beim WA-1-Isolat erfolgte die rWA-1-Erfassung durch Kontakte bei 1 dpi, war bei 4 dpi abgeschlossen und die Kontaktablösungstiter nahmen ab 4 dpi ab (Abb. 4d). ΔORF6 war sowohl hinsichtlich des Beginns als auch der Dynamik und des Erwerbs des Kontaktabwurfs dem rWA-1 der Eltern ähnlich (Abb. 4e). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass das Fehlen von ORF6 die Übertragung in unserem Modell nicht wesentlich abschwächt. Der Beginn der Akquisition war für ΔORF8 ähnlich wie bei rWA-1 und ΔORF6, 1 dpi, aber im Gegensatz zu den anderen beiden rekombinanten Viren war die Steigung der Akquisition langsamer und die Übertragung betrug 76 % (Abb. 4f). Wir nehmen an, dass diese Verringerung der Übertragungseffizienz eine Folge der geringeren Häutungstiter der Indexmäuse ist.

Als nächstes analysierten wir die Zytokinspiegel in URT- und Lungenproben von Indexmäusen mittels Multiplex-ELISA (Abb. 4g). Wir fanden heraus, dass die in der URT von mit ΔORF8 infizierten Mäusen vorhandenen Zytokinspiegel eine ähnliche Größenordnung hatten wie die von mit rWA-1 und ΔORF6 infizierten Mäusen, trotz 100-fach niedrigerer WA-1-ΔORF8-Titer zum gleichen Zeitpunkt (2 dpi). Dies deutet auf eine erhöhte Entzündungssignatur von ΔORF8 im Verhältnis zur in der URT vorhandenen Virusmenge hin. In Lungen, die bei allen drei Viren ähnliche Virustiter aufweisen (Abb. 4g), beobachteten wir ein ähnliches Zytokinmuster zwischen ΔORF8- und rWA-1-infizierten Mäusen (Abb. 4g). Wie und ob eine Entzündung durch ΔORF8 die Virusreplikation speziell im URT, nicht jedoch in der Lunge, abschwächt, bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen. Bemerkenswert ist, dass die Zytokinspiegel in ΔORF6-infizierten Lungen im Vergleich zu sowohl rWA-1- als auch ΔORF8-infizierten Lungen, insbesondere IL-6, erhöht waren, was darauf hindeutet, dass das rekombinante Virus, dem ORF6 fehlt, nicht in der Lage ist, die Produktion bestimmter Zytokine in der Lunge von Neugeborenen zu unterdrücken Mäuse.

Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, wie die Entfernung eines SARS-CoV-2-Akzessorproteins, ORF8, die URT-Replikation reduziert, was zu einer geringeren Ausscheidung und Übertragung bei neugeborenen Mäusen führt. Unser neugeborenes Mausmodell ermöglicht einen einzigartigen Blick auf diese molekularen Prozesse in räumlicher Granularität, und die Verfügbarkeit mausspezifischer Reagenzien wird zukünftige mechanistische Studien zur Rolle von ORF8 bei der URT-Replikation und -Übertragung ermöglichen.

Mausmodelle der SARS-CoV-2-Infektion wurden ausgiebig genutzt, um die Pathogenese neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten zu untersuchen46,47,48,49,50,51,52. Erwachsene Mäuse übertragen SARS-CoV-2 jedoch nicht robust (Ergänzende Abbildungen 1a – f und Lit. 27). In unserer Studie haben wir ein neonatales Mausmodell entwickelt und validiert, um die Übertragung menschlicher SARS-CoV-2-Isolate auf der Grundlage unserer früheren Erfahrungen mit dem Influenza-A-Virus zu charakterisieren (Abb. 1 und Lit. 17). Anhand eines einzigartigen SARS-CoV-2-Panels, das frühe bis aktuelle pandemische menschliche Isolate umfasst, zeigen wir, wie sich Varianten-inhärente Mutationen auf Tropismus und Ausscheidung (Abb. 2), Übertragung (Abb. 3) und das Zytokinrepertoire der oberen Atemwege auswirken (ergänzende Abb . 4). Schließlich enthüllt unsere Studie eine bisher nicht erkannte Rolle des akzessorischen Proteins ORF8 bei der Replikation, Entzündung und Übertragung von Viren in den oberen Atemwegen bei neugeborenen Mäusen (Abb. 4) und zeigt die Leistungsfähigkeit unseres Modells zur Untersuchung der viralen und wirtsmolekularen Determinanten von SARS -CoV-2-Übertragung bei Mäusen.

Unser Modell hat gegenüber bestehenden Tiermodellen zur SARS-CoV-2-Übertragung mehrere Vorteile: Erstens ermöglicht die Zugänglichkeit für eine breite Palette verfügbarer Knockout-Tiere künftige systematische Studien zur Bestimmung der für die Übertragung entscheidenden Wirtsfaktoren. Zweitens ermöglicht unser Modell leistungsstarke Studien, da eine hohe Anzahl von Kontakten mit neugeborenen Mäusen einfacher zu erreichen ist als in anderen Tiermodellen. Drittens stellt die Arbeit mit Mäusen im Vergleich zu Hamstern oder Frettchen weniger Herausforderungen in der Haltung dar. Darüber hinaus erhöht die Verfügbarkeit mausspezifischer Reagenzien und Werkzeuge das Potenzial, virusinduzierte Immunwege im Wirt sowie Atmungsmechanismen zu untersuchen, die sich auf die Übertragung auswirken könnten, wie z. B. Luftstrom und Lungenkapazität. Schließlich können wir dank der nicht-invasiven Probenahme den Verlauf des Index und die Kontaktinfektion im Längsschnitt verfolgen. Dies ermöglicht eine detailliertere Darstellung und einen besseren Einblick in die Kinetik der Virusausscheidung und der URT-Viruslast auf individueller Ebene, was unser Verständnis der Übertragungseffizienz verdeutlicht.

Obwohl diese Merkmale unser Modell als einzigartiges und praktikables Werkzeug zur Untersuchung der SARS-CoV-2-Übertragung etablieren, haben andere Tiermodelle wie Hamster und Frettchen bestimmte Vorteile gegenüber den Einschränkungen unseres Systems. Eine Einschränkung unseres Modells besteht darin, dass die Übertragungswege nicht experimentell getestet werden können, da säugende Mäuse nicht voneinander oder von ihrer Mutter getrennt werden können. Es ist wahrscheinlich, dass die Übertragung im Modell, wie beim Menschen53,54, über eine Kombination von Modi erfolgt. Eine weiträumige Aerosolübertragung, wie sie beim Menschen auftreten kann55, kann in unserem aktuellen Versuchsaufbau nicht gemessen werden. Dennoch weist das Modell Verhaltenssituationen auf, die sowohl für die Übertragung von Influenzaviren als auch für SARS-CoV-2 günstig sind, wie sowohl beim Menschen als auch in klassischeren Tiermodellsystemen gezeigt: längere Expositionsdauer56, Nähe von Personen in geschlossenen Räumen57 und Zusammenleben mit Haushaltsmitgliedern54. 58,59,60. Darüber hinaus ermöglicht uns unsere nicht-invasive Probenentnahmemethode von einzelnen Welpen die zeitliche Dynamik und Amplitude der Virusausscheidung in Längsrichtung zu messen, beides Faktoren, die für die Übertragung von Atemwegsviren von entscheidender Bedeutung sind17,33,34,61,62,63. Eine weitere Einschränkung unseres Modells besteht darin, dass die Expression des hACE2-Transgens durch einen nicht-nativen K18-Promotor gesteuert wird, was die Infektion mehrerer Organe ermöglicht und zu Gewebeexpressionsniveaus führt, die sich von endogen exprimiertem Maus-Ace249,50 unterscheiden. Obwohl die Expression nicht physiologisch ist, haben wir für diese erste Studie zur SARS-CoV-2-Übertragung bei Mäusen bewusst K18-hACE2-Mäuse ausgewählt, da unser Ziel darin bestand, die Übertragung früher und aktueller pandemischer Isolate zu untersuchen und zu vergleichen, von denen einige dazu nicht in der Lage sind greife das Maus-Ass2 an. Wir sind uns bewusst, dass bei der Extrapolation von Tropismusänderungen in unserem Modell auf Tropismus beim Menschen Vorsicht geboten ist, insbesondere wenn diese Änderungen ausschließlich durch Änderungen in der Bindungsvariante von Spike-ACE2 verursacht werden, dh durch Mutationen in der Rezeptorbindungsstelle von Spike. Wir argumentieren jedoch, dass Tropismusveränderungen, die durch Unterschiede in der Spike-Verarbeitung und/oder durch Unterschiede in der Wirt-Virus-Interaktion hervorgerufen werden, mit unserem Modell leicht interpretiert werden können, da Proteaseexpression und Entzündung oder Antagonismus durch das hACE2-Transgen unverfälscht werden. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, wie die Auswahl der verfügbaren Tiermodelle auf dem Forschungsumfang und -kontext basieren sollte, da jedes von ihnen wertvolle und nicht redundante Informationen zur SARS-CoV-2-Biologie liefern kann.

In unserem Modell beobachteten wir mit Ausnahme von Omicron BA.1 eine Übertragung von SARS-CoV-2-Varianten bei oder über 33 %, und unsere Methode war granular genug, um subtile Unterschiede zwischen den Varianten zu erkennen. Beispielsweise haben wir einen frühen, aber schmalen Höhepunkt der URT-Replikation für Alpha identifiziert, sodass nur ein kurzes Zeitfenster für die Übertragung übrig blieb. Trotzdem erwerben Kontakttiere Alpha mit einer ähnlichen Rate wie WA-1 der Vorfahren und weisen sogar deutlich höhere Kontakttiter bei 3 dpi auf. Tatsächlich war Alpha das einzige Virus mit einer ähnlichen oder besseren Übertragungseffizienz wie WA-1, während alle anderen Varianten im Vergleich zu WA-1 eine deutliche Übertragungsverzögerung aufwiesen. Post-Alpha-Varianten entstanden nach einer weit verbreiteten Immunität der Bevölkerung, die entweder durch eine vorherige Infektion oder Impfung hervorgerufen wurde, und die Umgehung der Virusneutralisierung aufgrund von Mutationen im Spike-Gen der Varianten ist gut dokumentiert64,65,66,67,68,69,70. Daher spekulieren wir, dass die Übertragungsunterschiede zwischen WA-1 und den Varianten Beta bis Delta unter adaptivem Immundruck möglicherweise weniger dramatisch waren oder sogar einen Übertragungsvorteil für diese Varianten im Vergleich zum Vorfahrenvirus aufzeigen, auf das derzeit die meisten Immunisierungsschemata abgestimmt sind. Zukünftige Studien mit diesem Modell werden adaptiven Immundruck durch Impfung von Muttertieren vor der Trächtigkeit einführen. Nachkommen erwerben Immunglobuline über die Plazentapassage oder über Milch, was in unserem Influenza-A-Virusmodell nachweislich die Übertragung verringert17.

Das akzessorische Protein ORF8 von SARS-CoV-2 ist wohl das rätselhafteste, da es nur eine 20-prozentige Proteinidentität mit SARS-CoV aufweist. Für SARS-CoV-2 ist ORF8 ein sekretiertes Glykoprotein40,71,72 und es wurden verschiedene immunmodulatorische Funktionen vorgeschlagen, wie z. B. IL-17A-Mimikry73,74, Interferon-Typ-I-Interferenz43, Histon-Mimikry75 und Herunterregulierung der MHC-Klasse I76,77, obwohl das gesamte Spektrum der Funktionen und Wirkmechanismen von ORF8 noch geklärt werden muss78. In unserem Modell führte die Löschung von ORF8 zu einer verringerten Replikation speziell im URT. Die Stärke der entzündlichen Zytokine (Abb. 4), die wir für ΔORF8 im URT beobachten, war ähnlich der des parentalen WA-1- oder ΔORF6-Virus, obwohl in diesem Kompartiment 100-fach weniger Virus vorhanden war. Diese erhöhte Entzündung ähnelte früheren Beobachtungen bei erwachsenen K18-hACE-Mäusen41,45. Es ist möglich, dass SARS-CoV-2 ohne ORF8 nicht in der Lage ist, kritische antivirale Reaktionen im URT zu unterdrücken. Wir argumentieren, dass die verringerte URT-Replikation und die daraus resultierende Verringerung der Ausscheidung die Ursache für die verzögerte und verringerte Übertragung von ΔORF8 bei Mäusen ist. Wir argumentieren weiterhin, dass dies nicht auf eine allgemeine Abschwächung von SARS-CoV-2 ohne ORF8 zurückzuführen ist, da sich diese Viren in Gewebekulturen und in der Lunge sowohl neugeborener als auch erwachsener K18-hACE2-Mäuse effizient replizieren (Abb. 4 und Lit. 45). ). Nach unserem Kenntnisstand ist dies der bisher einzige Bericht über eine kompartimentspezifische Rolle eines SARS-CoV-2-Akzessorproteins bei Mäusen. Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen für die URT-spezifische Rolle von ORF8 unbekannt bleiben, ist es möglich, dass antivirale Entzündungsprozesse, die durch eine SARS-CoV-2-Infektion hervorgerufen werden, im URT anders sind als in den unteren Atemwegen. Beispielsweise können das zelluläre Milieu und die Temperaturunterschiede zwischen URT und LRT eine Rolle für das Verhalten des Virus und die Reaktion auf eine Infektion in diesen Kompartimenten spielen. Darüber hinaus sind die schlechte Konservierung von ORF8 unter verwandten Coronaviren78, das Auftreten einer 382-Nukleotid-Deletion im ORF8 von SARS-CoV-2-Isolaten bei Patienten im Februar 2020 und die Zirkulation eines SARS-CoV-2-Isolats, das eine verkürzte Version von enthielt, zu verzeichnen ORF8 von März bis Oktober 202079 legen nahe, dass ORF8 ein Hotspot für die Anpassung und Entwicklung von SARS-CoV-2 ist78. Beispielsweise trägt die Alpha-Variante, die wir ebenfalls in unserer Studie charakterisierten, ein Stoppcodon an der Aminosäure 27 von ORF8, was zur Expression eines verkürzten ORF8-Proteins führt1. Interessanterweise zeigten ΔORF8 und Alpha in unserem Modell keine Phänokopie im Hinblick auf URT-Replikation, Zytokinreaktionen oder Übertragung. Es ist möglich, dass der verkürzte ORF8 von Alpha Funktionen beibehält, die für die URT-Replikation von entscheidender Bedeutung sind. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass der ORF8 von Alpha nicht mehr funktioniert, aber andere virale Proteine, von denen sich einige vom WA-1-Hintergrund unterscheiden, über redundante Immunsuppressionsmechanismen verfügen, die die fehlende ORF8-Aktion in Alpha ausgleichen. Zukünftige Studien mit zusätzlichem rekombinanten SARS-CoV-2 werden es ermöglichen, die verschiedenen Hypothesen zu entwirren.

Was sind die Determinanten der SARS-CoV-2-Übertragung in unserem Modell? Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Höhe des Infektiös-Index-Shedding-Titers im Hinblick auf die Übertragungseffizienz von Bedeutung ist. Wir stellen fest, dass geringere Indexverluste mit einer verringerten Übertragungseffizienz korrelieren, wie beide getesteten Omicron-Varianten und ΔORF8 zeigen. Darüber hinaus stellen wir fest, dass ein früher Zeitpunkt des Spitzenwerts bei der Indexablösung (1 dpi gegenüber 2 oder 3 dpi) die Übertragungseffizienz begünstigt, wie der leichte Übertragungsvorteil von Alpha gegenüber WA-1 und der deutliche Übertragungsvorteil von Omicron BQ.1.1 gegenüber BA zeigen .1. Schließlich stellen wir fest, dass die URT-Virustiter mit den Ausscheidungstitern aller in dieser Studie getesteten Viren korrelieren, was insgesamt darauf hindeutet, dass eine effiziente, früh einsetzende URT-Replikation die SARS-CoV-2-Übertragungseffizienz in unserem Modell bestimmt. Im Gegensatz dazu stellten wir in unserem Modell fest, dass es keinen Zusammenhang zwischen der Ausscheidung von SARS-CoV-2 und den Virustitern im LRT gab, was darauf hindeutet, dass das in der Lunge vorhandene Virus möglicherweise in erster Linie für die Krankheitsentstehung verantwortlich ist Erleichterung seiner Übertragung.

Zusammenfassend haben wir mit neugeborenen transgenen K18-hACE2-Mäusen ein SARS-CoV-2-Übertragungsmodell erstellt, das den Nettoeffekt von varianteninhärenten Mutationen auf den viralen Tropismus und die Übertragung charakterisiert und den Beitrag akzessorischer Proteine ​​zur Übertragung aufdeckt. Die Verwendung dieses handhabbaren Tiermodells zur Definition der molekularen Mechanismen, die der Übertragung von SARS-CoV-2 zugrunde liegen, könnte die Entwicklung überlegener antiviraler Therapien leiten und zu einem besseren Verständnis nicht nur von SARS-CoV-2, sondern von Atemwegsviren im Allgemeinen beitragen.

Vero E6-Zellen wurden von ATCC (CRL-1586) erhalten und in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Atlanta Biologicals), 1 % Pen/Strep (Gibco) und 1 % Amphotericin B (Gibco) bei 37 °C mit 5 % CO2. Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 wurden von BEI Resources (NR-54970, RRID: CVCL_C7NK) erhalten und in DMEM (Corning) kultiviert, das 4 mM L-Glutamin, 4500 mg pro L Glucose, 1 mM Natriumpyruvat und 1500 mg pro L enthielt L-Natriumbicarbonat, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 10 μg pro ml Puromycin (Sigma) bei 37 °C mit 5 % CO2. Bei der Ankunft und in monatlichen Abständen wurde bestätigt, dass beide Zelllinien frei von Mykoplasmen waren.

C57BL/6 J- und K18-hACE2 C57BL/6 J-Mäuse (Stamm 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) (Jackson Laboratories, ME) wurden in einer herkömmlichen Tierhaltung gehalten und gezüchtet. Um neonatale heterozygote K18-hACE2 C57BL/6 J-Mäuse für die Übertragungsexperimente zu produzieren, wurden C57BL/6 J-Weibchen mit homozygoten K18-hACE2 C57BL/6 J-Männchen gezüchtet. Die Welpen wurden während aller Experimente bei ihrer Mutter untergebracht. In allen Experimenten wurden Versuchstiere beiderlei Geschlechts verwendet und zur Analyse in Gruppen zusammengefasst. Tierversuche wurden in der Einrichtung der Tierbiosicherheitsstufe 3 (ABSL3) der NYU Grossman School of Medicine (New York, NY) gemäß dem Biosicherheitshandbuch und den Standardarbeitsanweisungen durchgeführt. Die Studie erhielt die ethische Genehmigung des NYU Grossman School of Medicine Animal Care and Use Committee (IACUC) gemäß dem IACUC-Protokoll Nr. IA18-00071 (Dittmann).

Sämtliche Arbeiten mit infektiösen SARS-CoV-2-Isolaten und rekombinanten Viren, einschließlich der Arbeiten mit infizierten Tieren, wurden in den Einrichtungen der Tierbiosicherheitsstufe 3 (ABSL3) der University of Maryland (Baltimore, MD) und der NYU Grossman School of Medicine (New York) durchgeführt York, NY). Beide Einrichtungen sind bei ihren jeweiligen örtlichen Gesundheitsbehörden registriert und haben innerhalb des Jahres nach Einreichung dieses Manuskripts die Inspektionen durch die Centers for Disease Control & Prevention (CDC (Centers for Disease Control)) bestanden. ABSL3-Einrichtungen werden gemäß ihren Biosicherheitshandbüchern und Standardarbeitsanweisungen betrieben, einschließlich der Eindämmung biologisch gefährlicher Aerosole unter Verwendung zertifizierter Biosicherheitsschränke und der versiegelten Belüftungssysteme der Einrichtungen, die einen anhaltenden gerichteten Luftstrom von sauberen zu potenziell kontaminierten Bereichen sowie HEPA- gefiltertes Abgas. Biogefährlicher Abfall, der in den Einrichtungen anfällt, wird mit zugelassenen Desinfektionsmitteln vollständig dekontaminiert, gefolgt von einer Autoklavierung und Verbrennung als regulierter medizinischer Abfall. Der Zugang zu ABSL3-Einrichtungen ist zertifiziertem und autorisiertem Personal vorbehalten, das an Programmen zur Gesundheitsüberwachung am Arbeitsplatz teilnimmt und angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) trägt, darunter von der OSHA zugelassene Atemschutzmasken, Augenschutz, auslaufsichere Overalls und Doppelhandschuhe. Bei der Analyse außerhalb von ABSL3-Einrichtungen wurden infektiöse Proben mithilfe geprüfter Inaktivierungsmethoden gründlich behandelt.

Alle Arbeiten mit infektiösen SARS-CoV-2-Isolaten und rekombinanten Viren wurden mit vorheriger Genehmigung der Institutional Biosafety Committees (IBCs) der University of Maryland School of Medicine und der NYU Grossman School of Medicine durchgeführt. Importgenehmigungen für Isolate der SARS-CoV-2-Variante wurden von der CDC genehmigt. Die Erzeugung rekombinanter SARS-CoV-2-Viren wurde vom IBC (Institutional Biosafety Committee) der University of Maryland School of Medicine für MF zugelassen.

Die folgenden Reagenzien wurden von BEI Resources, NIAID, NIH (National Institutes of Health) bezogen: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281, hinterlegt von den Centers for Disease Control and Prevention; SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/England/204820464/2020, B.1.1.7, NR-54000, beigetragen von Bassam Hallis; SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/South Africa/KRISP-EC-K005321/2020 (NR-54008), beigesteuert von Alex Sigal und Tulio de Oliveira; SARS-Related Coronavirus 2, Isolat hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 (Brasilien P.1), NR-54982, bereitgestellt vom National Institute of Infectious Diseases, SARS-CoV-2 Delta-Variante, Isolat hCoV19/USA/ PHC658/2021, B.1.617.2, NR-55611. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 (hCoV-19/USA/GA-EHC-2811C/2021, EPI_ISL_7171744) wurden freundlicherweise vom Suthar Lab an der Emory University zur Verfügung gestellt. SARS-CoV-2 hCoV-19/USA/CA-Stanford-106_S04/2022 (Omicron BQ1.1, EPI_ISL_15196219) wurde von Dr. Mehul Suthar (Emory University, Atlanta, Georgia, USA) und Dr. Benjamin Pinsky (Stanford) erhalten Universität, Stanford, Kalifornien, USA). Der Schaft USA-WA1/2020 wurde wie zuvor beschrieben80 hergestellt. Die anderen SARS-CoV-2-Viren wurden einmal in Vero E6-Zellen passagiert, denen 1 µg/ml L-1-Tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon (TPCK)-Trypsin zugesetzt wurde, um eine Virusadaption an Vero E6-Zellen aufgrund der zu vermeiden Mangel an TMPRSS2-Expression. Die Zellen wurden mit einer MOI von 0,01 infiziert und bei 50 % zytopathischem Effekt (CPE) geerntet. Nach der Ernte wurde das Virus unter Verwendung eines 25 %igen Saccharosekissens bei 25.000 U/min für 3–4 Stunden gereinigt und vor der Infektion mit PBS (Phosphate Buffered Saline) resuspendiert. Für die B.1.1.7-, B.1.1.351- und P.1-Bestände wurden Aliquots zunächst Plaque-gereinigt und sequenziert, um die Variantensignatur zu verifizieren, bevor sie in Gegenwart von TPCK-Trypsin expandierten, um einen Durchgang-1-Arbeitsstamm zu erzeugen. Wir führen einen Schritt zum Ausschluss von Zelltrümmern durch Tischzentrifugation durch, bevor wir mit dem Pelletierungsschritt des Virus durch ein Saccharosekissen fortfahren. Anschließend resuspendieren wir das Pellet in einem geringen Volumen, was zu hochkonzentrierten, gereinigten SARS-CoV-2-Vorräten führt. WA-1 ΔORF6, WA-1ΔORF8 und seine WA-1-Kontrolle wurden im Frieman Lab an der University of Maryland School of Medicine61 erzeugt; Aliquots wurden wie für die Experimente bereitgestellt verwendet. Für hitzeinaktiviertes (HI) SARS-CoV-2 WA-1 wurden Virusbestände 5 Stunden lang bei 56 °C inkubiert. Zur Bestätigung der vollständigen Inaktivierung infektiöser Partikel wurden die Proben titriert.

Wie oben beschrieben infizierte Welpen wurden gemäß einem humanen, von der IACUC genehmigten Verfahren mit 2 dpi eingeschläfert. Die Kopfhaut wurde vorsichtig entfernt, um die Nasenstrukturen zu erhalten. Anschließend wurden die Köpfe entfernt und für ein kurzes Waschen in PBS bei 4 °C getaucht, gefolgt von einer 72-stündigen Fixierung in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C ohne Schütteln. Anschließend wurden die Köpfe 20 Minuten lang in PBS bei 4 °C unter leichtem Schwenken gewaschen und anschließend 7 Tage lang in 0,12 M EDTA-Lösung bei 4 °C unter leichtem Schütteln entkalkt. Intakte Köpfe wurden dann durch abgestuftes Ethanol zu Xylol verarbeitet und in einem automatischen Gewebeprozessor von Leica Peloris mit Paraffin infiltriert. In Paraffin eingebettete Schnitte wurden auf einem Leica BondRX gemäß den Anweisungen des Herstellers immungefärbt. Kurz gesagt, entparaffinierte Schnitte wurden einer 20-minütigen Wärmegewinnung in Leica ER2-Puffer (pH9, AR9640) unterzogen, gefolgt von Rodent Block (Biocare, RBM961 L), bevor eine einstündige Inkubation mit SARS-CoV-2 N-Protein-Antikörper (Klon 1C7C7, Cell Signaling Technology, Kat.-Nr. 68344) bei einer Verdünnung von 1:300 und eine AF594-konjugierte Ziege-Anti-Maus-Sekundärlösung (ThermoFisher, Kat.-Nr. A11005) bei 1:100. Die Objektträger wurden mit DAPI gegengefärbt. Die halbautomatische Bildaufnahme wurde mit einem multispektralen Bildgebungssystem Vectra® Polaris durchgeführt. Nach dem Scannen des gesamten Objektträgers bei 20-facher Vergrößerung wurde das Gewebe manuell umrissen, um Felder für die spektrale Entmischung und Bildanalyse mithilfe der Software InForm® Version 2.6 von Akoya Biosciences auszuwählen. Forschungsbilddaten wurden mit OMERO Plus v5.6 (Glencoe Software) zum Anzeigen, Kommentieren und/oder Erstellen von Figuren mit OMERO.figure v 4.4 (OME-Team) verwaltet.

Erwachsene hemizygote C57BL/6 J K18-hACE2+/- Mäuse (13 Wochen alt, beide Geschlechter) wurden mit einer tödlichen Dosis (10.000 PFU) des angestammten SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 über eine 10 μL intranasale Infektion infiziert Ketamin/Xylazin-Anästhesie. Männliche und weibliche Mäuse wurden getrennt in Vierergruppen mit einem Verhältnis von infiziertem Index zu nicht infiziertem Kontakt von 1:3 gehalten. Die Virusausscheidung wurde erfasst, indem die Nasenlöcher jeder Maus 10 Tage lang dreimal täglich in virales Medium (PBS plus 0,3 % Rinderserumalbumin [BSA]) getaucht wurden. Die Übertragung innerhalb des Käfigs wurde durch das Vorhandensein infektiöser Partikel bei Kontaktmäusen bestimmt. Der prozentuale Erwerb wurde wie unten beschrieben bewertet und dargestellt. Moribunde wurden durch CO2-Erstickung und anschließende Zervixluxation eingeschläfert, wenn die humanen Endpunktkriterien erfüllt waren. Bei 10 dpi wurden überlebende Tiere durch CO2-Erstickung und anschließende Herzpunktion eingeschläfert. Retrotracheale Spülungen der oberen Atemwege überlebender Tiere wurden durchgeführt, indem 500 μl steriles PBS durch die Luftröhre und aus den Nasenlöchern gedrückt wurden. Die Lungen wurden gesammelt und mit Edelstahlperlen wie unten beschrieben homogenisiert.

Um die Serokonversion aufgrund der Übertragung zu beurteilen, wurden erwachsene Mäuse (13 Wochen alt) wie oben beschrieben infiziert und getrennt in Gruppen von 1:3 und 1:2 Infiziertenindex: nicht infizierte Kontakte gehalten. 13 Wochen alte männliche Mäuse wurden mit 10 μL sterilem PBS und 12 Wochen alte weibliche Mäuse mit einer 10 μL subletalen Dosis SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 (1000 PFU) geimpft. Die Mäuse wurden täglich auf Gewicht und Überleben überwacht. Drei Wochen nach der Infektion wurden die Tiere durch CO2-Erstickung und anschließende Herzpunktion eingeschläfert. Retro-Trachealspülung des URT und Lungenhomogenisate wurden wie oben beschrieben gesammelt. Das Blut wurde mittels Herzpunktion mit einer 1-ml-28G1/2-Insulinspritze gesammelt und in ein Serumsammelröhrchen (BD Microtainer 365967) gegeben. Die Röhrchen wurden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Blutgerinnung zu erleichtern, und dann 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert (1500 × g). Das Serum wurde abgetrennt, bei –80 °C eingefroren und auf das Vorhandensein von IgG-Antikörpern gegen Spike Trimer (Acro Biosystems RAS-T023) analysiert.

Neugeborene Mäuse galten als Mäuse im Alter von 4–7 Tagen. Das Geschlecht der einzelnen Jungtiere wurde nicht bestimmt und daher wurden wahrscheinlich in allen Experimenten mit neugeborenen Mäusen Tiere beiderlei Geschlechts verwendet. Die Welpen wurden mit einem 3 μl sterilen PBS-Inokulum ohne Vollnarkose (um eine direkte Lungenimpfung zu vermeiden) durch intranasale Instillation von 1500 PFU SARS-CoV-2 WA-1, SARS-CoV-2-Variante oder rekombinantem SARS-CoV-2 infiziert Für die Dauer des Experiments kehrten sie zum Pflegedamm zurück. Bei Übertragungsexperimenten wurden ein oder zwei Jungtiere, wie in der Legende der Abbildung angegeben, infiziert und für die Dauer des Experiments zu den (nicht infizierten) Wurfgeschwistern zurückgebracht. Die Virusausscheidung wurde durch dreimaliges tägliches Eintauchen der Nasenlöcher jeder Maus in virales Medium (PBS plus 0,3 % Rinderserumalbumin [BSA]) gesammelt und die Proben wurden mittels quantitativer Reverse-Transkription-PCR (RT-qPCR) oder Plaque-Assay ausgewertet. Die Übertragung innerhalb des Wurfes wurde durch die tägliche Entnahme von Fellproben bei den Wurfgeschwistern (Kontakt) beurteilt. Die %-Akquisition wurde in invertierten Kaplan-Meier-Diagrammen visualisiert. Akquisitionsereignisse wurden als mindestens zwei Tage dauernder infektiöser Virustiter in ausscheidenden Proben gewertet. Der Beginn der Akquisition wurde als erster Tag des Nachweises infektiöser Viren gewertet. Die Welpen und die Mutter wurden durch CO2-Erstickung und anschließende Herzpunktion eingeschläfert. Die oberen Atemwege (URT) wurden einer retrotrachealen Lavage unterzogen (Ausspülen von 300 μl PBS aus der Luftröhre und Sammeln durch die Nasenlöcher), und Proben wurden zur Quantifizierung von Viren verwendet (mittels Plaque-Assay oder qRT-PCR). Das Verhältnis von Index zu Kontaktwelpen lag zwischen 1:6 und 9 beim Variantenvergleich und zwischen 1:3 und 1:4 bei der Modelloptimierung mit WA-1.

RNA-Extraktionen wurden mit dem Qiagen QIAamp Viral RNA Kit durchgeführt. Die Anzahl der viralen N-Kopien pro µL wurde durch RT-qPCR unter Verwendung des Taqman® RNA-to-CT One-Step RT-PCR-Kits (Applied BiosystemsTM) mit SARS-CoV-2-Primern und einer Sonde, die auf ein Amplifikat im N abzielt, quantifiziert Protein von SARS-CoV-2 WA-1 (Vorwärts: 5'ATGCTGCAATCGTGCTACAA3'; Rückwärts: 5' GACTGCCGCCTCTGCTC3') und die Sonde 5'/56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/3'. Für jeden Datensatz wurde eine Standardkurve unter Verwendung der in vitro transkribierten SARS-CoV-2-N-RNA-Sequenz (MN985325.1) erstellt.

Infektiöse Virustiter wurden durch Plaque-Assay bestimmt. Kurz gesagt, 10-fache Verdünnungen jedes Virus in DMEM + 1 % Antibiotikum/Antimykotikum (Gibco) wurden 1 Stunde lang bei 37 °C zu einschichtigen Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2-Zellen gegeben. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 0,8 % Agarose in DMEM mit 2 % FBS überschichtet und 36 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden mit 10 % Formalin fixiert, der Agarosepfropfen entfernt und die Plaques durch Kristallviolettfärbung sichtbar gemacht. Bestände und Proben aus Mausexperimenten (Ausscheidung, Spülung und Lungenhomogenate) wurden in Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 titriert.

Die Lungen wurden in 500 µl DPBS mit einer Edelstahlperle (QIAGEN) gesammelt, mit dem Tissue-Lyser II (QIAGEN) homogenisiert und die Trümmer 8 Minuten lang bei 8000 U/min nach unten gezogen. Die Virustiter wurden durch einen Plaque-Assay unter Verwendung von Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2-Zellen bestimmt.

Die Zytokin- und Chemokinspiegel wurden im Mäuseserum mit dem Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay (Bio-Rad) gemessen. Zytokine und Chemokine wurden auf einem MAGPIX-Gerät (Luminex) aufgezeichnet und durch Vergleich mit einer Standardkurve quantifiziert. Für die Datenerfassung und -analyse wurde die Software xPONENT Version 4.3.229.0 verwendet. Wir haben die experimentell ermittelten Nachweisgrenzen für jedes Protein verwendet und Werte unterhalb dieser Nachweisgrenze auf einen Logarithmus unter der Grenze festgelegt. Alle Proben wurden auf diejenigen von PBS-behandelten Tieren normalisiert. Geclusterte Heatmaps wurden mit dem ComplexHeatmap-Paket v.2.14.0 generiert.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 9.5 durchgeführt. Jedes Experiment wurde mindestens zwei unabhängige Male mit internen biologischen Duplikaten durchgeführt, sofern in den Legenden der Abbildungen nichts anderes angegeben ist. Die Daten werden als geometrischer Mittelwert ± geometrische Standardabweichung (SD) dargestellt. Kruskal-Wallis- und Log-Rank-Mantel-Cox-Tests wurden durchgeführt und in den Legenden der Abbildungen ausdrücklich angegeben. In den Abbildungen wurden nur p-Werte < 0,05 angezeigt und p-Werte > 0,05 galten als nicht signifikant (ns).

Die genaue Anzahl der biologischen Replikate (n) ist die folgende:

Abbildung 1

b Index n = 4, Kontakt n = 9

c Index n = 4, Kontakt n = 9

d Index n = 4, Kontakt n = 9

e Index n = 4, Kontakt n = 9

fn = 1 Maus

Figur 2

bn = 8 für Längsabwurf, n = 7 für Tag-2-Probenahme

cn = 15 für Längsabwurf, n = 13 für Tag-2-Probenahme

dn = 7 für Längsabwurf, n = 5 für Tag-2-Probenahme

en = 8 für Längsabwurf, n = 6 für Tag-2-Probenahme

fn = 7 für Längsabwurf, n = 5 für Tag-2-Probenahme

gn = 12 für Längsabwurf, n = 5 für Tag-2-Probenahme

hn = 1 Maus pro SARS-CoV-2-Variante

Figur 3

an = 12 für Längsabwurf, n = 12 für Kaplan-Meier-Diagramme

bn = 27 für Längsabwurf, n = 27 für Kaplan-Meier-Plots

cn = 14 für Längsabwurf, n = 14 für Kaplan-Meier-Plots

dn = 15 für Längsabwurf, n = 15 für Kaplan-Meier-Plots

en = 13 für Längsabwurf, n = 13 für Kaplan-Meier-Plots

fn = 8 für Längsabwurf, n = 8 für Kaplan-Meier-Diagramme

gn = 12 für Längsabwurf, n = 12 für Kaplan-Meier-Plots

Figur 4

an = 7 für Längsabwurf, n = 5 Tag 2 Probenahme

bn = 8 für Längsabwurf, n = 6 Tag 2 Probenahme

cn = 10 für Längsabwurf, n = 8 Tag 2 Probenahme

dn = 12 für Längsabwurf, n = 12 für Kaplan-Meier-Plots

en = 14 für Längsabwurf, n = 14 Tag 2 Probenahme

fn = 13 für Längsabwurf, n = 13 Tag 2 Probenahme

gn = 19 für einzelne URT-Proben (PBS n = 6, r-WA-1 n = 4, ORF6 n = 5, ORF8 n = 4), n = 21 für einzelne Lungenproben (PBS n = 6, r-WA- 1 n = 5, ORF6 n = 5, ORF8 n = 5)

hn = 1 Maus pro SARS-CoV-2-Variante

Ergänzende Abbildung 1

b Gewicht: Index n = 3 (m = 2, f = 1), Kontakt n = 9 (m = 6, f = 3)

c Überlebenskurve: Index n = 3 (m = 2, f = 1), Kontakt n = 9 (m = 6, f = 3)

d Längsablösung: Index n = 3 (m = 2, f = 1), Kontakt n = 9 (m = 6, f = 3)

e Endpunkt Lungentiter: Kontakt n = 9 (m = 6, f = 3)

f Serokonversion (Kontrolle und Kontakt): n = 11 (PBS n = 3 (m = 3), subletale n = 3 (f = 3), Kontakte n = 5 (m = 2, f = 3))

h Gewicht: n = 12 (1500 PFU n = 6, 15000 PFU n = 3, 50000 PFU n = 3)

i Mortalitätsereignisse: n = 21 (1500 PFU n = 9, 15000 PFU n = 9, 50000 PFU n = 3)

j Längstiter: n = 12 (1500 PFU n = 3, 15000 PFU n = 3, 50000 PFU n = 3)

k Längsablösung: n = 11

Ergänzende Abbildung 2:

Titer eines Längskompartiments: Tag 1: n = 5, Tag 2: n = 7, Tag 3: n = 4

b Längskompartimenttiter: Tag 1: n = 11, Tag 2: n = 13

c-Kompartiment-Titer: Tag 1: n = 6

d Längsablösungstiter: n = 11

e Längskompartimenttiter: Tag 1: n = 5

fn = 1 Maus

Ergänzende Abbildung 3:

an = 12 für Kontakte, n = 2 für Index

bn = 27 für Längsabwurf, n = 4 für Index

cn = 14 für Längsabwurf, n = 2 für Index

dn = 15 für Längsabwurf, n = 2 für Index

en = 13 für Längsabwurf, n = 2 für Index

fn = 8 für Längsabwurf, n = 2 für Index

gn = 12 für Längsabwurf, n = 2 für Index

Ergänzende Abbildung 4:

an = 19 für einzelne URT-Proben (PBS n = 6, r-WA-1 n = 4, ORF6 n = 5, ORF8 n = 4), bn = 21 für einzelne Lungenproben (PBS n = 6, r-WA- 1 n = 5, ORF6 n = 5, ORF8 n = 5)

Ergänzende Abbildung 5:

a r-WA-1 Längsgewicht: Index n = 4, Kontakt n = 16, Längsüberleben (Todesfälle): Index: n = 3, Kontakt n = 14

b ORF6-Längsgewicht: Index n = 2, Kontakt n = 14, Längsüberleben (Todesfälle): Index: n = 2, Kontakt n = 7

c ORF8-Längsgewicht: Index n = 2, Kontakt n = 13, Längsüberleben (Todesfälle): Index: n = 2, Kontakt n = 6

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Daten werden in der Datei „Ergänzende Informationen/Quelldaten“ bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

https://covariants.org.

Kyriakidis, NC, Lopez-Cortes, A., Gonzalez, EV, Grimaldos, AB & Prado, EO SARS-CoV-2-Impfstoffstrategien: eine umfassende Überprüfung der Phase-3-Kandidaten. NPJ Vaccines 6, 28 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, P. et al. Ein Ausbruch einer Lungenentzündung im Zusammenhang mit einem neuen Coronavirus, das wahrscheinlich von Fledermäusen stammt. Natur 579, 270–273 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, B., Guo, H., Zhou, P. & Shi, ZL Merkmale von SARS-CoV-2 und COVID-19. Nat Rev Microbiol 19, 141–154 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Minkoff, JM & tenOever, B. Angeborene Immunevasionsstrategien von SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol 21, 178–194 (2023).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xia, H. et al. Umgehung von Typ-I-Interferon durch SARS-CoV-2. Cell Rep 33, 108234 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kopecky-Bromberg, SA, Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, RA & Palese, P. Offener Leserahmen (ORF) 3b, ORF 6 und Nukleokapsidproteine ​​des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus fungieren als Interferonantagonisten. J Virol 81, 548–557 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Konno, Y. et al. SARS-CoV-2 ORF3b ist ein starker Interferonantagonist, dessen Aktivität durch eine natürlich vorkommende Elongationsvariante erhöht wird. Cell Rep 32, 108185 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schroeder, S. et al. Interferon-Antagonismus durch SARS-CoV-2: eine funktionelle Studie mit umgekehrter Genetik. Lancet Microbe 2, e210–e218 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shemesh, M. et al. SARS-CoV-2 unterdrückt die durch NSP1, 5, 6, 15, ORF6 und ORF7b vermittelte IFNbeta-Produktion, unterdrückt jedoch nicht die Wirkung von zugesetztem Interferon. PLoS Pathog 17, e1009800 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callaway, E. Was die BA.4- und BA.5-Varianten von Omicron für die Pandemie bedeuten. Natur 606, 848–849 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Lamers, MM & Haagmans, BL SARS-CoV-2-Pathogenese. Nat Rev Microbiol 20, 270–284 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, Z. et al. Eine Landschaftsanalyse von Escape-Varianten identifiziert SARS-CoV-2-Spike-Mutationen, die die Neutralisierung monoklonaler Antikörper und Serumantikörper abschwächen. bioRxiv (2021). https://doi.org/10.1101/2020.11.06.372037.

Richard, M. et al. SARS-CoV-2 wird durch Kontakt und über die Luft zwischen Frettchen übertragen. Nat Commun 11, 3496 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sia, SF et al. Pathogenese und Übertragung von SARS-CoV-2 bei Goldhamstern. Natur 583, 834–838 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Imai, M. et al. Syrische Hamster als Kleintiermodell für die SARS-CoV-2-Infektion und die Entwicklung von Gegenmaßnahmen. Proc Natl Acad Sci USA 117, 16587–16595 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ortigoza, MB, Blaser, SB, Zafar, MA, Hammond, AJ & Weiser, JN Ein Säuglings-Mausmodell der Influenzavirus-Übertragung zeigt die Rolle der virusspezifischen Ausscheidung, der humoralen Immunität und der Sialidase-Expression bei der Kolonisierung von Streptococcus pneumoniae. mBio 9 (2018). https://doi.org/10.1128/mBio.02359-18.

Rodewald, AK, Onderdonk, AB, Warren, HB & Kasper, DL Neugeborenes Mausmodell einer Streptokokkeninfektion der Gruppe B. J Infect Dis 166, 635–639 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abruzzo, AR, Aggarwal, SD, Sharp, ME, Bee, GCW & Weiser, JN Serotyp-abhängige Auswirkungen auf die Dynamik der Pneumokokken-Kolonisierung und Auswirkungen auf die Übertragung. mBio 13, e0015822 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Zafar, MA et al. Die Identifizierung von Pneumokokkenfaktoren, die die Ausscheidung von Pneumokokken beeinflussen, zeigt, dass der dlt-Locus Entzündungen und Übertragung fördert. mBio 10 (2019).https://doi.org/10.1128/mBio.01032-19.

Zafar, MA, Kono, M., Wang, Y., Zangari, T. & Weiser, JN Säuglingsmausmodell zur Untersuchung der Ausscheidung und Übertragung während einer Streptococcus pneumoniae-Monoinfektion. Infect Immun 84, 2714–2722 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zangari, T., Ortigoza, MB, Lokken-Toyli, KL & Weiser, JN Typ-I-Interferon-Signalisierung ist ein gemeinsamer Faktor, der die Ausscheidung und Übertragung von Streptococcus pneumoniae und Influenza-A-Viren vorantreibt. mBio 12 (2021). https://doi.org/10.1128/mBio.03589-20.

Compton, SR, Paturzo, FX & Macy, JD Übertragung des Mausparvovirus auf neugeborene Mäuse. J Am Assoc Lab Anim Sci 51, 797–802 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, P. et al. Rezeptorbindung und komplexe Strukturen von menschlichem ACE2 zur Erhöhung der RBD von Omicron und Delta SARS-CoV-2. Zelle 185, 630–640.e610 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, H., Zhu, Y., Niu, Z., Zhou, L. & Sun, Q. Besorgniserregende SARS-CoV-2 N501Y-Varianten und ihre mögliche Übertragung durch die Maus. Cell Death Differ 28, 2840–2842 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCray, PB Jr. et al. Tödliche Infektion von K18-hACE2-Mäusen, die mit dem schweren Coronavirus des akuten respiratorischen Syndroms infiziert sind. J Virol 81, 813–821 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pan, T. et al. Die Infektion von Wildtyp-Mäusen durch die SARS-CoV-2-Variante B.1.351 weist auf einen möglichen neuen artübergreifenden Übertragungsweg hin. Signal Transduct Target Ther 6, 420 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lowen, AC, Mubareka, S., Tumpey, TM, Garcia-Sastre, A. & Palese, P. Das Meerschweinchen als Übertragungsmodell für menschliche Influenzaviren. Proc Natl Acad Sci USA 103, 9988–9992 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edenborough, KM, Gilbertson, BP & Brown, LE Ein Mausmodell zur Untersuchung der kontaktabhängigen Übertragung des Influenza-A-Virus und der Faktoren, die die Übertragbarkeit steuern. J Virol 86, 12544–12551 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosenke, K. et al. Die Variante UK B.1.1.7 (Alpha) weist bei nichtmenschlichen Primaten eine erhöhte respiratorische Replikation und Ausscheidung auf. Emerg Microbes Infect 10, 2173–2182 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

von Wintersdorff, CJH et al. Bei Infektionen mit der SARS-CoV-2-Delta-Variante ist die Viruslast in den oberen Atemwegen im Vergleich zu Alpha oder Nicht-Besorgniserregenden Varianten um das Vierfache erhöht. Sci Rep 12, 13922 (2022).

Artikel ADS Google Scholar

Yan, J. et al. Infektiöses Virus in der Ausatemluft symptomatischer saisonaler Influenza-Fälle einer Universitätsgemeinschaft. Proc Natl Acad Sci USA 115, 1081–1086 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Danzy, S., Lowen, AC & Steel, J. Ein quantitativer Ansatz zur Beurteilung der Fitness und Übertragung des Influenza-A-Virus bei Meerschweinchen. J Virol 95 (2021). https://doi.org/10.1128/JVI.02320-20.

Mubareka, S. et al. Übertragung des Influenzavirus über Aerosole und Keime im Meerschweinchenmodell. J Infect Dis 199, 858–865 (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Port, JR et al. Wirts- und Virusdeterminanten der Luftübertragung von SARS-CoV-2 beim Syrischen Hamster. bioRxiv (2023). https://doi.org/10.1101/2022.08.15.504010.

Yuan, S. et al. Pathogenität, Übertragbarkeit und Fitness von SARS-CoV-2 Omicron bei syrischen Hamstern. Wissenschaft 377, 428–433 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Halfmann, PJ et al. Das SARS-CoV-2-Omicron-Virus verursacht bei Mäusen und Hamstern eine abgeschwächte Erkrankung. Natur 603, 687–692 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boon, ACM et al. Reduzierte Luftübertragung des SARS-CoV-2 BA.1 Omicron-Virus bei syrischen Hamstern. PLoS Pathog 18, e1010970 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leung, NHL Übertragbarkeit und Übertragung von Atemwegsviren. Nat Rev Microbiol 19, 528–545 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silvas, JA et al. Beitrag von SARS-CoV-2-Akzessorproteinen zur viralen Pathogenität in K18-humanen ACE2-transgenen Mäusen. J Virol 95, e0040221 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Liu, Y. et al. Ein abgeschwächter Lebendimpfstoffkandidat gegen SARS-CoV-2 mit akzessorischen Proteindeletionen. Nat Commun 13, 4337 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kehrer, T. et al. Einfluss von SARS-CoV-2 ORF6 und seinen Variantenpolymorphismen auf Wirtsreaktionen und virale Pathogenese. bioRxiv (2022). https://doi.org/10.1101/2022.10.18.512708.

Li, JY et al. Die Proteine ​​ORF6, ORF8 und Nukleokapsid von SARS-CoV-2 hemmen den Typ-I-Interferon-Signalweg. Virusforschung 286, 198074 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miorin, L. et al. SARS-CoV-2 Orf6 kapert Nup98, um den STAT-Kernimport zu blockieren und die Interferonsignalisierung zu antagonisieren. Proc Natl Acad Sci USA 117, 28344–28354 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGrath, ME et al. Spike- und akzessorische Genmutationen der SARS-CoV-2-Variante verändern die Pathogenese. Proc Natl Acad Sci USA 119, e2204717119 (2022).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bayarri-Olmos, R. et al. Die alpha/B.1.1.7 SARS-CoV-2-Variante weist eine deutlich höhere Affinität zu ACE-2 auf und erfordert niedrigere Impfdosen, um bei K18-hACE2-Mäusen eine Erkrankung auszulösen. Elife 10 (2021). https://doi.org/10.7554/eLife.70002.

Shuai, H. et al. Abgeschwächte Replikation und Pathogenität von SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Natur 603, 693–699 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Horspool, AM et al. Die besorgniserregenden Varianten SARS-CoV-2 B.1.1.7 und B.1.351 lösen bei transgenen K18-hACE2-Mäusen trotz Rekonvaleszenz-Plasmatherapie eine tödliche Erkrankung aus. bioRxiv (2021). https://doi.org/10.1101/2021.05.05.442784.

Winkler, ES et al. SARS-CoV-2 verursacht bei menschlichen ACE2-Knock-In-Mäusen eine Lungeninfektion ohne schwere Erkrankung. J Virol 96, e0151121 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Winkler, ES et al. Eine SARS-CoV-2-Infektion menschlicher ACE2-transgener Mäuse verursacht schwere Lungenentzündungen und Funktionsstörungen. Nat Immunol 21, 1327–1335 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. SARS-CoV-2 passt sich in alten BALB/c-Mäusen schnell an und löst eine typische Lungenentzündung aus. J Virol 95 (2021). https://doi.org/10.1128/JVI.02477-20.

Yasui, F. et al. Eine Infektion mit der Variante SARS-CoV-2 B.1.351 ist bei alten BALB/c-Mäusen tödlich. Sci Rep 12, 4150 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ribaric, NL, Vincent, C., Jonitz, G., Hellinger, A. & Ribaric, G. Versteckte Gefahren der SARS-CoV-2-Übertragung in Krankenhäusern: Eine systematische Übersicht. Innenluft 32, e12968 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cowling, BJ et al. Die Aerosolübertragung ist ein wichtiger Übertragungsweg des Influenza-A-Virus. Nat Commun 4, 1935 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Duval, D. et al. Übertragung von SARS-CoV-2 über große Entfernungen in der Luft: schnelle systematische Überprüfung. BMJ 377, e068743 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Ganti, K. et al. Der Zeitpunkt der Exposition ist in einem hochempfindlichen Modell der SARS-CoV-2-Übertragung von entscheidender Bedeutung. PLoS Pathog 18, e1010181 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moon, J. & Ryu, BH Übertragungsrisiken von Atemwegsinfektionskrankheiten in verschiedenen geschlossenen Räumen: Eine Metaanalyse für zukünftige Pandemien. Environ Res 202, 111679 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Poon, LL et al. Variationen der viralen genetischen Sequenz bei pandemischen H1N1/2009- und saisonalen H3N2-Influenzaviren innerhalb eines Individuums, eines Haushalts und einer Gemeinschaft. Journal of Clinical Virology: die offizielle Veröffentlichung der Pan American Society for Clinical Virology 52, 146–150 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Madewell, ZJ, Yang, Y., Longini, IM Jr., Halloran, ME & Dean, NE Haushaltsübertragung von SARS-CoV-2: Eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. JAMA Netw Open 3, e2031756 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker, JM et al. SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) Variantenübertragung innerhalb von Haushalten – Vier US-Gerichtsbarkeiten, November 2021 – Februar 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 71, 341–346 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Puhach, O., Meyer, B. & Eckerle, I. SARS-CoV-2-Viruslast und Ausscheidungskinetik. Nat Rev Microbiol 21, 147–161 (2023).

CAS PubMed Google Scholar

Cevik, M. et al. Dynamik der Viruslast von SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV, Dauer der Virusausscheidung und Infektiosität: eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. Lancet Microbe 2, e13–e22 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Port, JR et al. Die Schwere der SARS-CoV-2-Erkrankung und die Übertragungseffizienz sind bei syrischen Hamstern in der Luft im Vergleich zur Fomite-Exposition erhöht. Nat Commun 12, 4985 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu, P. et al. Umgehung neutralisierender Antikörperreaktionen durch die Variante SARS-CoV-2 BA.2.75. Cell Host Microbe 30, 1518–1526 e1514 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wibmer, CK et al. SARS-CoV-2 501Y.V2 entgeht der Neutralisierung durch südafrikanisches COVID-19-Spenderplasma. Naturmedizin 27, 622–625 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Planas, D. et al. Erheblicher Austritt von SARS-CoV-2 Omicron zur Antikörperneutralisierung. Natur 602, 671–675 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bruel, T. et al. Längsschnittanalyse der Serumneutralisierung von SARS-CoV-2 Omicron BA.2, BA.4 und BA.5 bei Patienten, die monoklonale Antikörper erhalten. Cell Rep Med 3, 100850 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Planas, D. et al. Reduzierte Empfindlichkeit der SARS-CoV-2-Variante Delta gegenüber Antikörperneutralisierung. Natur 596, 276–280 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bruel, T. et al. Serumneutralisierung der SARS-CoV-2-Omicron-Sublinien BA.1 und BA.2 bei Patienten, die monoklonale Antikörper erhalten. Naturmedizin 28, 1297–1302 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoffmann, M. et al. Die Omicron-Variante ist hochresistent gegen Antikörper-vermittelte Neutralisierung: Implikationen für die Kontrolle der COVID-19-Pandemie. Zelle 185, 447–456.e411 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Matsuoka, K. et al. Das SARS-CoV-2-Zusatzprotein ORF8 wird extrazellulär als Glykoprotein-Homodimer sezerniert. J Biol Chem 298, 101724 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, X. et al. Die unkonventionelle Sekretion von nicht glykosyliertem ORF8 ist entscheidend für den Zytokinsturm während einer SARS-CoV-2-Infektion. PLoS Pathog 19, e1011128 (2023).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, X. et al. ORF8 trägt zum Zytokinsturm während einer SARS-CoV-2-Infektion bei, indem es den IL-17-Signalweg aktiviert. iScience 24, 102293 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, X. et al. Virale Mimikry von Interleukin-17A durch SARS-CoV-2 ORF8. mBio 13, e0040222 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Kee, J. et al. SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur 610, 381–388 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. Das ORF8-Protein von SARS-CoV-2 vermittelt die Immunumgehung durch Herunterregulieren von MHC-Iota. Proc Natl Acad Sci USA 118 (2021). https://doi.org/10.1073/pnas.2024202118.

Selvaraj, C. et al. Analyse der SARS-CoV-2-ORF8-Dimerisierung und des Bindungsmodus mit Klasse-I-MHC: Computeransätze zur Identifizierung von COVID-19-Inhibitoren. Kurze Funktionsgenomik (2023). https://doi.org/10.1093/bfgp/elac046.

Pereira, F. Evolutionäre Dynamik des SARS-CoV-2 ORF8-Akzessor-Gens. Infect Genet Evol 85, 104525 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeRonde, S., Deuling, H., Parker, J. & Chen, J. Identifizierung einer neuen SARS-CoV-2-Variante mit einem verkürzten Protein im ORF8-Gen durch Sequenzierung der nächsten Generation. Sci Rep 12, 4631 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Vries, M. et al. Eine vergleichende Analyse antiviraler SARS-CoV-2-Medikamente charakterisiert den 3CL(pro)-Inhibitor PF-00835231 als potenzielle neue Behandlung für COVID-19. J Virol 95 (2021). https://doi.org/10.1128/JVI.01819-20.

Referenzen herunterladen

Wir danken Thomas M. Moran, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, und Luis Martínez-Sobrido, Texas Biomedical Institute, für die freundliche Spende des monoklonalen Maus-SARS-CoV-N-Antikörpers 1C7 sowie Mehul Suthar, Emory School of Medicine, und Benjamin Pinsky, Stanford University, für die Schenkung der Varianten. Wir danken Ashley Fisher und Nicole Rondeau für ihre Unterstützung bei der Zusammenstellung der Quelldatendatei. Wir danken dem SARS-CoV-2 Assessment of Viral Evolution (SAVE) Program für kritischen Input zu unseren Daten. Die Histopathologie des murinen Nasopharynx wurde von Mark Alu und Branka Brukner Dabovic vom NYUMC Experimental Pathology Research Laboratory (RRID: SCR_017928) durchgeführt. Sowohl das Experimental Pathology Research Laboratory als auch der NYU Genome Technology Core werden durch den Förderzuschuss P30CA016087 des NYU Cancer Center und durch das Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center der NYU Langone unterstützt. Der Multispektralscanner Vectra Polaris wurde über einen Shared Instrument Grant S10 OD021747 erworben. Wir danken auch dem NYU Langone Antimicrobial-Resistant Pathogens (AMR) Program und Adriana Heguy und dem Team vom NYU Genome Technology Core für die Tiefensequenzierung aller in dieser Studie verwendeten Viren. Die Forschung wurde teilweise durch die folgenden Zuschüsse von NIH/NIAID unterstützt: R01AI143639 an MD, K08AI141759 an MBO, R01AI143861 an KMK, DK093668 an KC und T32AI007180. Keine der Arbeiten mit rekombinantem SARS-CoV-2 an der NYU Grossman School of Medicine wurde vom NIAID finanziert. Die Arbeit wurde außerdem vom Vilcek Institute of Graduate Biomedical Sciences und durch Startgelder der NYU Grossman School of Medicine unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bruno A. Rodriguez-Rodriguez, Grace O. Ciabattoni.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Mila B Ortigoza, Meike Dittmann.

Abteilung für Mikrobiologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, 10016, USA

Bruno A. Rodriguez-Rodriguez, Grace O. Ciabattoni, Ralf Duerr, Ana M. Valero-Jimenez, Stephen T. Yeung, Keaton M. Crosse, Austin R. Schinlever, Lucie Bernard-Raichon, Joaquin Rodriguez Galvan, Kamal M. Khanna , Mila B. Ortigoza & Meike Dittmann

Abteilung für Medizin/Abteilung für Infektionskrankheiten und Immunologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, 10016, USA

Ralf Dürr, Ludovic Desvignes & Mila B. Ortigoza

Vaccine Center, NYU Grossmann of Medicine, New York, NY, 10016, USA

Ralf Dürr

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Zentrum für Pathogenforschung, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, 21201, USA

Marisa E. McGrath und Matthew B. Frieman

Abteilung für Synthetische Biologie und Bioenergie, J. Craig Venter Institute, Rockville, MD, 20850, USA

Sanjay Vashee & Yong Xue

Abteilung für Pathologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, 10016, USA

Cynthia A. Loomis

Perlmutter Cancer Center, New York University Langone Health, New York, NY, 10016, USA

Kamal M. Khanna

Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Abteilung für Medizin, Perelman School of Medicine der University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Ken Cadwell

Abteilung für Systempharmakologie und translationale Therapeutik, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, PA, 19104, USA

Ken Cadwell

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, PA, 19104, USA

Ken Cadwell

High Containment Laboratories – Büro für Wissenschaft und Forschung, NYU Langone Health, New York, NY, 10016, USA

Ludovic Desvignes

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

BAR-R.: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung. GOC: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. RD: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Visualisierung. AMV-J.: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. STY: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. KMC: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. ARS: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. LB-R.: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. JJRG: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. MEM: Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. SV: Methodik, Ressourcen. Yong Xue: Methodik, Ressourcen. Cynthia Loomis: Methodik, Supervision. KMK: Methodik, Betreuung, Fördermittelakquise. Kenneth Cadwell: Methodik, Aufsicht, Mittelbeschaffung. Ludovic Desvignes: Methodik, Ressourcen, Betreuung, Schreiben – Rezension und Bearbeitung. Matthew B. Frieman: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Aufsicht, Mittelbeschaffung, Schreiben – Rezension und Bearbeitung. Mila B Ortigoza: Konzeptualisierung, Methodik, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung, Überwachung, Finanzierungsakquise. Meike Dittmann: Konzeptualisierung, Methodik, Formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung, Betreuung, Fördermittelakquise.

Korrespondenz mit Mila B. Ortigoza oder Meike Dittmann.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Nicole M. Bouvier und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Rodriguez-Rodriguez, BA, Ciabattoni, GO, Duerr, R. et al. Ein neonatales Mausmodell charakterisiert die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2-Varianten und zeigt eine Rolle von ORF8. Nat Commun 14, 3026 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 21. Oktober 2022

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 25. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.